CRISPR) ialah teknik penyuntingan genom generasi ketiga: CRISPR telah merevolusikan dunia

Ulangan palindromik pendek berselang-seli berkala berkelompok (CRISPR) ialah teknik penyuntingan genom generasi ketiga yang telah merevolusikan dunia dengan hasil daya pemprosesannya yang tinggi. Ia telah digunakan untuk merawat pelbagai penyakit dan jangkitan biologi. Pelbagai bakteria dan prokariot lain (seperti arkea) juga mempunyai sistem CRISPR/Cas9 untuk mempertahankan diri daripada faj. Telah dilaporkan bahawa strategi berasaskan CRISPR/Cas9 boleh menghalang pertumbuhan dan perkembangan kanser payudara tiga kali ganda negatif (TNBC) dengan mensasarkan gen rintangan yang berpotensi diubah, transkripsi dan pengawalaturan epigenetik. Intervensi terapeutik ini boleh membantu menangani masalah yang mencabar seperti rintangan ubat yang diperhatikan walaupun dalam TNBC. Pada masa ini, pelbagai kaedah digunakan untuk menghantar CRISPR/Cas9 kepada sel sasaran, seperti fizikal (suntikan mikro, elektroporasi dan mod hidrodinamik), virus (virus berkaitan adeno dan lentivirus) dan bukan virus (liposom dan nanopartikel lipid). )-partikel). Walaupun pelbagai model telah dibangunkan untuk mengkaji punca molekul TNBC, kekurangan kaedah sensitif dan disasarkan untuk menyampaikan alat penyuntingan genom secara in vivo mengehadkan aplikasi klinikal mereka. Secara ringkasnya, ulasan ini mengkaji secara menyeluruh kemajuan, cabaran, batasan dan prospek rawatan CRISPR/Cas9 untuk TNBC berdasarkan bukti sedia ada. Kami juga mengetengahkan bagaimana gabungan kecerdasan buatan dan pembelajaran mesin dapat meningkatkan strategi CRISPR/Cas9 dalam rawatan TNBC.
Kanser dicirikan oleh pembahagian sel yang tidak terkawal, gangguan titik semak kitaran sel, dan mutasi dalam gen penindas tumor (TSG) (Matthews et al., 2022). Antara jenis kanser yang berbeza, kanser payudara adalah jenis kanser yang paling biasa di kalangan wanita dan mempunyai kadar kematian yang tinggi di seluruh dunia (Waks dan Winer, 2019). Kanser payudara adalah penyakit heterogen dengan pelbagai ciri, seperti ciri histologi dan biologi, persembahan dan tingkah laku klinikal, dan tindak balas terhadap rawatan (Weigelt et al., 2010). Pengelasan kanser payudara memberikan pandangan yang tepat untuk diagnosis kanser payudara dan prognosis tumor. Penggunaan biomarker biasa dan ciri klinikopatologi telah menjadi kriteria utama untuk pengelasan kanser payudara (Tsang dan Tse, 2019). Prognosis dan tindak balas terhadap rawatan kanser payudara dipengaruhi oleh pelbagai faktor, termasuk kehadiran reseptor estrogen (ER), reseptor progesteron (PR), reseptor faktor pertumbuhan epidermis manusia 2 (HER2/neu), dan gred histologi, jenis tumor, dan gred, saiz dan metastasis nodus limfa (Al-Tubaiti, 2020). Lima subjenis molekul intrinsik kanser payudara telah dikenal pasti, termasuk luminal A, luminal B, diperkaya HER2, seperti basal, dan claudin-low (Prat et al., 2015). TNBC ialah subjenis molekul kanser yang tidak mengekspresikan semua ER, PR, dan HER2 (Yin et al., 2020). Ciri-ciri patologi ini dikaitkan dengan TNBC, mengesahkan perkembangan pesatnya dan sifatnya yang lebih agresif berbanding jenis kanser payudara yang lain (Feng et al., 2018). Selain itu, Peru et al (2000) menggunakan teknologi microarray untuk mengklasifikasikan semula kanser payudara dan mengenal pasti lima subjenis intrinsik kanser payudara (Cadenas, 2012). Kanser payudara seperti basal ialah subjenis kanser payudara yang mempunyai fenotip triple-negatif dan dikaitkan dengan perkembangan pesat. Perlu diingatkan bahawa semua kanser payudara seperti basal biasanya salah didiagnosis sebagai TNBC, tetapi hanya 77% adalah TNBC; Sebaliknya, 71–91% TNBC adalah seperti basal, menunjukkan bahawa kedua-dua jenis kanser payudara ini bertindih dan mewakili klasifikasi yang berbeza (Wang D.-Y. et al., 2019). Ini mewujudkan keperluan untuk mencirikan heterogeniti TNBC bagi menjelaskan prognosis dan mengenal pasti potensi tindak balas terhadap rawatan semasa dan akan datang. Selain itu, TNBC menyumbang 15–20% daripada semua kes kanser payudara dan lebih biasa berlaku pada wanita di bawah umur 50 tahun. Mutasi BRCA1 atau BRCA2 telah dilaporkan dalam kira-kira 20% kes TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Kajian juga menunjukkan bahawa TNBC mempunyai persekitaran mikro imun yang berbeza yang merangkumi tahap faktor pertumbuhan endotel vaskular yang tinggi, makrofaj berkaitan tumor (TAM), limfosit penyusupan tumor (TIL), dan molekul lain yang terlibat dalam pertumbuhan dan penghijrahan tumor. Oleh itu, memahami persekitaran mikro TNBC adalah penting untuk prognosis dan rawatannya (Fan dan He, 2022).
Untuk menilai prognosis TNBC dan memastikan rawatan yang berkesan, diagnosis yang tepat, terutamanya berdasarkan imunohistokimia (IHC) untuk mengesan ER, PR dan HER2, dan mamografi untuk mengesan neoplasma payudara, adalah penting. Walau bagaimanapun, mamografi tidak dapat menggambarkan ciri-ciri intratumoral seperti nekrosis dan fibrosis dengan secukupnya (Deepak Singh et al., 2021). Memandangkan prognosis dan diagnosis yang buruk menghalang doktor daripada menetapkan ubat yang betul (Chaudhary, 2020), pelbagai strategi digunakan untuk menambah baik penjagaan pesakit TNBC. Pada masa ini, dua ubat, doxorubicin dan cyclophosphamide, digunakan pada pesakit TNBC dan telah menunjukkan hasil yang baik. Di samping itu, ubat platinum lain digunakan, seperti carboplatin dan cisplatin (Sikov et al., 2015). Di samping itu, perencat PARP seperti Olaparib, Velaparib, dan PF-01367338 telah digunakan sebagai ubat kemoterapi yang berpotensi untuk rawatan TNBC (Ishino et al., 2018). Memandangkan laluan isyarat Wnt/b-Catenin, NOTCH dan Hedgehog telah dilaporkan terlibat dalam kejadian dan perkembangan TNBC, penyasaran ubat ke laluan ini mungkin merupakan strategi penting (Aysola et al., 2013). Walaupun pembedahan, terapi radiasi dan kemoterapi kekal sebagai tulang belakang rawatan untuk TNBC hari ini, kemajuan yang ketara telah dicapai dalam membangunkan rawatan baharu termasuk terapi sasaran, imunoterapi, pelbagai alat penyuntingan gen berkaitan CRISPR seperti Cas9n, dCas9., CRISPR/Cas12, penyuntingan utama dan terapi gen sasaran CRISPR/Cas9. Di sini kita akan menumpukan pada pelbagai alat penyuntingan gen berkaitan CRISPR yang digunakan dalam rawatan TNBC. Antaranya, CRISPR/Cas9 telah mendapat perhatian meluas.
Cas9n, juga dikenali sebagai Cas9 nickase, ialah varian kejuruteraan genetik protein Cas9 yang berasal daripada sistem penyuntingan genom CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Dalam bentuk asalnya, protein Cas9 mengandungi dua domain nuklease: RuvC dan HNH, yang fungsi utamanya ialah pembelahan kedua-dua untaian DNA. Walau bagaimanapun, dalam Cas9n, salah satu domain nuklease, HNH, telah bermutasi secara genetik dan menjadi tidak aktif. Oleh itu, domain HNH Cas9n kekal tidak berfungsi. Hanya domain RuvC yang kekal aktif, membolehkan Cas9n memotong atau mencipta rehat pada untaian DNA tunggal (Trevino dan Zhang, 2014). Berbanding dengan Cas9, Cas9n boleh mengurangkan kesan luar sasaran dengan berkesan dan meningkatkan mekanisme pembaikan sel dengan tepat. Cas9n boleh digunakan untuk menyelesaikan pelbagai masalah, seperti mencipta rehat di lokasi tertentu dalam DNA untaian dua. Untuk tujuan ini, dua molekul Cas9n telah digabungkan dan digunakan bersama (Yee, 2016). Kinase keturunan campuran 3 (MLK3) ialah kinase protein yang diaktifkan mitogen yang berfungsi sebagai pengawal selia utama semasa metastasis TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 boleh mengaktifkan pelbagai laluan isyarat yang membawa kepada metastasis TNBC. Contohnya, laluan kinase N-terminal c-Jun (JNK) mengawal selia motiliti sel dan degradasi matriks ekstraselular, dan MLK3 mengaktifkan laluan JNK, sekali gus meningkatkan motiliti sel dan memberikan sifat invasif (Rattanasinchai dan Gallo, 2016). MLK3 juga mengawal selia EMT. Untuk melakukan ini, ia mengaktifkan faktor transkripsi hiliran seperti Snail, Slug dan Twist. Faktor-faktor ini menghalang ekspresi penanda epitelium dan menggalakkan ekspresi penanda mesenchymal, yang membawa kepada pemerolehan fenotip metastatik (Casalino et al., 2023). MLK3 telah diperhatikan memainkan peranan dalam pembentukan semula ECM dan pengaktifan protease seperti metalloproteinase matriks (MMP) yang mendegradasi ECM. Ini memudahkan pencerobohan sel tumor dan penyebaran ke tapak yang jauh (Katari et al., 2019). Oleh itu, kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa MLK3 memainkan peranan penting dalam TNBC. Rattanasinchai dan Gallo menggunakan model TNBC untuk mengkaji peranan MLK3 dan mendapati ia menggalakkan perkembangan kanser melalui laluan isyarat tertentu. Mereka menggunakan CRISPR/Cas9n untuk mengedit MLK3 dan memerhatikan pengurangan ketara dalam metastasis TNBC (Rattanasinchai dan Gallo, 2016).
dCas9, yang sering dipanggil Cas9 tidak aktif, ialah bentuk terbitan protein Cas9 yang diubah suai. Tidak seperti Cas9 aktif, dCas9 kekurangan aktiviti endonuklease, menjadikannya tidak dapat mendorong pemecahan untaian berganda DNA. Oleh itu, dCas9 boleh digunakan untuk menyasarkan kawasan tertentu genom dengan tepat tanpa sebarang perubahan atau pengubahsuaian pada urutan DNA (Wang et al., 2016). Dalam dCas9, dua protein endonuklease, RuvC dan HNH, dinyahaktifkan dengan menyekat residu asid amino penting. (Richter et al., 2016). Walaupun kekurangan aktiviti pembelahan DNA, dCas9 memainkan beberapa peranan penting dalam penyelidikan genetik dan bioteknologi. Contohnya, ia membolehkan visualisasi kawasan tertentu genom, memudahkan pengawalaturan transkripsi dan menggalakkan pengubahsuaian epigenetik (Brocken et al., 2018).
Faktor transkripsi ZEB1 (homeobox 1 pengikatan zink jari E) memainkan peranan khusus dan kritikal dalam menjadi perantara peralihan epitelium-mesenkim (EMT), satu proses selular yang berlaku semasa perkembangan embrio, pembaikan tisu dan perkembangan kanser. Ia melibatkan transformasi sel epitelium kepada sel mesenkim, mengakibatkan perubahan dalam morfologi sel, motilitas, invasif, dan sebagainya (Wu et al., 2020). ZEB1 menghalang pelbagai penanda epitelium, seperti E-cadherin dan Occludin, yang bertanggungjawab untuk mengekalkan lekatan sel-sel dan kekutuban sel epitelium dalam TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Di samping itu, ZEB1 mengaktifkan penanda tertentu seperti N-cadherin, vimentin dan fibronektin (Konradi et al., 2014) dan juga mengawal selia gen yang terlibat dalam pembentukan semula sitoskeletal seperti Rho GTPases dan matriks metalloproteinases (MMP) (Huang). et al., 2014). 2022), di samping itu, ia juga mempengaruhi pelbagai laluan isyarat seperti faktor pertumbuhan transformasi-β (TGF-β), isyarat Wnt, dan sebagainya, sekali gus menggalakkan pencerobohan tumor dan metastasis dalam TNBC (Chen et al., 2016). Banyak kajian dan bukti saintifik menunjukkan bahawa ZEB1 mempunyai potensi besar sebagai agen berharga untuk pengesanan dan intervensi terapeutik TNBC. Dalam satu kajian baru-baru ini, Waryah et al. menggunakan model TNBC dan mencapai penindasan lengkap ZEB1 oleh dCas9. Oleh itu, mereka memerhatikan kekhususan yang sangat tinggi dan perencatan hampir lengkap ZEB1 dalam keadaan in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 ialah alat penyuntingan gen yang dipanggil CRISPR/Cpf1. Ia berasal daripada sistem CRISPR/Cas, di mana istilah Cas12 merujuk kepada protein 12 yang berkaitan dengan CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), yang sama sekali serupa dengan Cas9. Satu-satunya perbezaan ialah ia mengandungi protein Cas12. Berbanding dengan Cas9, Cas12 mempunyai beberapa fungsi unik seperti menghasilkan hujung melekit semasa proses penyuntingan gen, manakala Cas9 menghasilkan hujung tumpul (Wang et al., 2021). Sifat Cas12 ini menyumbang kepada teknologi manipulasi DNA khususnya. Sebagai protein yang mampu mengenali dan memotong DNA sasaran dengan tepat, ia mempunyai fleksibiliti yang luar biasa, menjadikannya alat yang berkesan untuk pelbagai aplikasi, termasuk penyuntingan gen (Pickar-Oliver dan Gersbach, 2019).
Sama seperti varian CRISPR yang lain, CRISPR/Cas12 juga mampu mematahkan atau mengaktifkan gen dalam TNBC, mensasarkan gen yang memainkan peranan penting dalam patogenesis atau tindak balasnya terhadap rawatan (Yang dan Zhang, 2023). Untuk mencapai proses ini, RNA panduan (gRNA) telah dibangunkan yang mengarahkan Cas12 kepada gen sasaran. Sebaik sahaja Cas12 mengikat pada sasarannya, ia memperkenalkan pemecahan untaian berganda dalam DNA dan mengaktifkan mekanisme pembaikan DNA. Semasa proses pembaikan, nukleotida yang salah mungkin digabungkan, yang membawa kepada mutasi gen dan kehilangan fungsi (Zhang et al., 2021a). Di samping itu, versi enzim Cas12 yang dipertingkatkan (dipanggil dCas12) juga digunakan untuk mengaktifkan gen. Dengan menggabungkannya dengan pengaktif transkripsi, adalah mungkin untuk mendorong gen tertentu, sekali gus mengaktifkannya. Teknologi ini mempunyai potensi besar dalam menggalakkan pengaktifan gen penindas tumor (Sultan et al., 2022).
Penyuntingan utama merupakan teknologi penyuntingan genom yang baru dibangunkan dan sangat unggul. Ia mampu mengubah suai DNA organisma dengan sangat tepat (Chen dan Liu, 2023). Penyuntingan utama dicapai melalui penyepaduan dua komponen utama: enzim CRISPR/Cas9 yang diubah suai dan transkriptase terbalik. Peranan enzim CRISPR/Cas9 adalah untuk menyasarkan tapak yang tepat dalam genom secara selektif, manakala transkriptase terbalik membantu mengubah suai DNA secara menyeluruh di lokasi sasaran (Hassan et al., 2021). Dalam mekanisme penyuntingan primer, langkah pertama melibatkan penciptaan RNA panduan penyuntingan primer (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Ia mengandungi jujukan sasaran dan templat RNA yang sepadan dengan tapak penyuntingan yang dikehendaki dalam DNA sasaran. PegRNA kemudiannya dimasukkan ke dalam sel sasaran bersama-sama dengan nuklease penyuntingan primer (PE2). PE2 ialah protein gabungan yang terdiri daripada enzim Cas9, transkriptase terbalik dan penyesuai penyuntingan primer (Martín-Alonso et al., 2021). Di dalam sel, pegRNA dan kompleks PE2 mencari DNA khusus yang ingin diubah suai. Enzim Cas9 memotong DNA dan mencipta templat yang terdiri daripada untaian tunggal (Choi et al., 2022). Transkriptase songsang menggunakan templat ini untuk menyediakan DNA untuk penyuntingan. Selain menyalin DNA, arahan untuk mengedit templat RNA juga disertakan. Akhir sekali, untaian DNA yang baru dicipta digunakan sebagai templat untuk membaiki kerosakan pada DNA, menghasilkan jujukan DNA yang diubah suai yang mengandungi pengubahsuaian yang diingini (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mekanisme penyuntingan primer boleh menyebabkan mutasi meluas dalam gen. Ia boleh menyasarkan mutasi titik, penyisipan, penghapusan dan juga penggantian gen (Anzalone et al., 2019; Chen dan Liu, 2023). Penyuntingan primer menawarkan beberapa kelebihan berbanding teknologi penyuntingan genom sebelumnya. Ini termasuk peningkatan ketepatan, pengurangan kesan luar sasaran dan keupayaan untuk mengedit DNA tanpa bergantung pada kerosakan untaian berganda DNA (Anzalone et al., 2020).
Teknologi CRISPR/Cas9 pada asalnya dibangunkan untuk melindungi bakteria daripada pemindahan plasmid dan jangkitan phage dan kemudiannya digunakan semula sebagai alat penargetan DNA berasaskan RNA yang berkesan untuk penyuntingan genom (Jiang dan Doudna, 2017). Di samping itu, sistem CRISPR/Cas9 telah dilaporkan hadir dalam 50% dan 87% genom bakteria dan arkea, masing-masing (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 merupakan alat yang berpotensi untuk penghapusan, penyisipan dan pembetulan sebarang jujukan genetik yang tidak normal menggunakan mod in vivo dan in vitro (Sabit et al., 2021). Selain itu, CRISPR/Cas9 telah terbukti menjadi sebahagian daripada sistem imun adaptif kerana kekhususannya untuk gen sasaran yang diminati (Chen dan Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 terdiri daripada Cas9 dan RNA panduan tunggal (sgRNA). Cas9 ialah endonuklease yang terdiri daripada pelbagai komponen protein. Di samping itu, Cas9 mempunyai sifat struktur dan konformasi yang unik (Pacesa et al., 2022) kerana ia terdiri daripada dua lobus: pengecaman (REC) dan nuklease (NUC). Lobus REC dibahagikan lagi kepada tiga kawasan: REC1, REC2, dan heliks jambatan (Cromwell et al., 2018). NUC terdiri daripada tiga lobus, iaitu RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH dan domain interaksi motif bersebelahan protospacer (PAM) (Rajah 1) (Song et al., 2016). sgRNA terdiri daripada dua komponen, termasuk RNA CRISPR (crRNA) dan transkoding RNA kecil (RNA penjejak) (Rajah 1). sgRNA menghubungkan protein Cas9 kepada koneksin untuk membentuk kompleks aktif, juga dikenali sebagai kompleks efektor (Richter et al., 2012). crRNA ialah pasangan bes nukleotida 18–20 yang memainkan peranan penting dalam mengenali jujukan DNA sasaran. Di samping itu, crRNA berpasangan dengan DNA sasaran, dan tracrRNA bertindak sebagai perancah untuk nuklease Cas9 untuk mengikat DNA sasaran (Manghwar et al., 2019). Sebaliknya, jujukan PAM mempunyai 3 nukleotida, yang mengesahkan, menentukan dan menjadi perantara pengikatan kompleks efektor kepada DNA. Subunit kompleks protein Cas9 RuvC dan HNH mempunyai aktiviti pemangkin (Richter et al., 2012; Asmamaw dan Zawdie, 2021). Domain nuklease HNH bagi subunit Cas9 membelah untaian DNA yang berkaitan dengan crRNA. Domain nuklease RuvC membelah untaian DNA lain dan menghasilkan pemecahan untaian berganda (DSB), selepas itu dua mekanisme pembaikan pemecahan DNA yang berbeza diaktifkan (Jiang dan Doudna, 2017) (Rajah 1).
Rajah 1. Gambaran Keseluruhan CRISPR/Cas9 (A). Komponen sistem CRISPR/Cas9: (i). Endonuklease Cas9 bertanggungjawab untuk memotong jujukan DNA sasaran, (ii) RNA panduan tunggal (sg) yang terhasil daripada gabungan kimera crRNA dan tra-crRNA. (dua). Cas9 merangkumi beberapa komponen seperti Rec I, Rec II, lobus NUC (HNH dan Ruv C adalah subkomponen) dan domain interaksi PAM (C) dengan fungsi yang sepadan. Kompleks protein CRISPR/Cas9 membelah jujukan DNA kepada bentuk bukan pelengkap dan pelengkap (D). CRISPR/Cas9 mengedit genom dalam tiga peringkat: pengecaman, pemotongan dan pembaikan. sg-RNA yang direka bentuk membimbing Cas9 dan mengenali jujukan yang dikehendaki melalui komponen pelengkap crRNA. Cas9 mengenali jujukan PAM pada 5′-NGG-3′ dan mencairkan DNA, membentuk hibrid DNA-RNA dan mengaktifkan pembelahan. Domain HNH Cas9 membelah untaian pelengkap, dan domain RuvC membelah untaian bukan pelengkap. CRISPR/Cas9 membaiki dsDNA dengan memecahkannya dalam dua cara: penyambungan hujung bukan homolog (NHEJ) dan pembaikan diarahkan homologi (HDR). NHEJ membaiki DNA untaian berganda tanpa kehadiran DNA homolog asing melalui proses enzimatik, mekanisme yang mudah terdedah kepada ralat yang boleh memasukkan atau mengalih keluar jujukan DNA rawak. HDR sangat spesifik dan memerlukan templat DNA homolog.
Laluan pembaikan yang dimediasi CRISPR/Cas9 merangkumi mekanisme penyambungan hujung bukan homolog (NHEJ) dan pembaikan yang diarahkan oleh homologi (HDR). NHEJ adalah laluan yang mudah mengalami ralat kerana ia melibatkan penyisipan atau pemadaman dan tidak memerlukan sebarang corak semasa mekanisme pembaikan. Ia menggunakan nukleotida rawak untuk menghasilkan protein piawai (Abbasi et al., 2021). Sistem pembaikan ini terdiri daripada empat kompleks seperti kompleks KU, kompleks protein pelengkap silang jenis 4 (XRCC-4), enzim pemprosesan hujung DNA dan DNA-PKcs protein kinase (Abbasi et al., 2021). Protein kompleks KU mempunyai dua subunit, Ku 70 dan Ku 80, dan memainkan peranan penting dalam mekanisme NHEJ, kerana mekanisme pembaikan dimulakan oleh pengikatan dua subunit (Ku 70 dan Ku 80) pada hujung DNA sasaran yang tumpul atau hampir tumpul (Abbasi et al., 2021), berfungsi sebagai perancah untuk merekrut faktor lain yang berkaitan dengan NHEJ ke tapak kecederaan (Yang et al., 2020). XRCC-4 dan DNA ligase masing-masing terdiri daripada 334 dan 911 asid amino, dan kompleks XRCC4-DNA ligase IV merangsang ligasi hujung DNA (Chatterjee et al., 2015). Enzim pemprosesan hujung DNA, juga dikenali sebagai polinukleotida kinase 3′-fosfat, ialah enzim pemprosesan hujung DNA. Ia boleh menyingkirkan kumpulan 3′P dalam DNA dan memfosforilasi kumpulan 5′OH semasa pembaikan DSB. Ia juga melibatkan pembaikan kerosakan untaian tunggal (SSB) menggunakan laluan pembaikan SSB (Chatterjee et al., 2015). Protein kinase DNA-PKcs ialah protein kinase yang bergantung kepada DNA yang terdiri daripada subunit pemangkin PIKK (kinase berkaitan fosfatidilinositol 3-kinase) dan keluarga ataxia telangiectasia mutated (ATM), serta ATR berkaitan ATM dan Rad3. kerosakan untaian (DSB) dan kerosakan untaian tunggal (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR merupakan mekanisme pembaikan yang lebih tepat dan sesuai kerana maklumat tersebut disalin menggunakan bentuk utuh dupleks DNA homolog, walaupun ia memerlukan kehadiran kromatid saudara. Ini berlaku semasa fasa S/G2 kitaran sel mamalia. HDR berlaku terutamanya dalam spesies yis, tetapi NHEJ adalah kritikal dalam mamalia (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Mekanisme pembaikan lengkap ditunjukkan dalam Rajah 1.
Oleh kerana TNBC disebabkan oleh keabnormalan genetik dan epigenetik, pembetulan keabnormalan genomik/epigenomik malignan menggunakan CRISPR/Cas9 mungkin merupakan pendekatan terapeutik yang munasabah (Chen et al., 2019). Di samping itu, beberapa faktor transkripsi yang terlibat dalam pengawalaturan transkripsi khusus sel mungkin menunjukkan ciri-ciri unik sel kanser, menunjukkan bahawa pengawalaturan transkripsi mungkin merupakan pendekatan yang sangat baik untuk rawatan kanser (Drost et al., 2017). Mengeksploitasi ciri-ciri molekul tumor ini, seperti kecacatan genetik, epigenetik dan transkripsi, untuk pembangunan ubat boleh meningkatkan hasil klinikal dan mengurangkan kos saringan. CRISPR ialah alat penyuntingan gen berpotensi yang bukan sahaja boleh mengesan dan mengenal pasti sasaran genomik penyebab kanser, tetapi juga boleh digunakan untuk mengedit, menyekat dan mengubah suai onkogen secara epigenetik dalam sel manusia (Jadual 1) (Ahmed et al., 2021). Beberapa saringan CRISPR telah dijalankan untuk mencari gen yang berkaitan dengan penekan tumor, onkogen dan rintangan ubat. Penggunaan CRISPR/Cas9 untuk mengedit pelbagai onkogen TNBC ditunjukkan dalam Rajah 2.
Rajah 2. Penyuntingan gen pelbagai onkogen TNBC menggunakan CRISPR/Cas9 yang mengakibatkan pertumbuhan tumor dan metastasis yang berkurangan. Onkogen ini termasuk CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 dan CXCR7, Crypto1, ROR1 dan ST8SIA, yang terlibat dalam kejadian dan metastasis TNBC.
Migrasi, pencerobohan, dan peralihan epitelium-mesenkim (EMT) sel kanser dikaitkan dengan ITGA9. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa ITGA9 merupakan pemain utama dalam laluan Notch dan memainkan peranan yang menarik dalam metastasis rhabdomyosarcoma (Molist et al., 2020). Di samping itu, ITGA9 didapati berkait rapat dengan prognosis pesakit dalam beberapa jenis tumor, termasuk kanser payudara (Wang Z. et al., 2019). Di samping itu, analisis bioinformatik ITGA9 menunjukkan bahawa ekspresinya dalam TNBC adalah jauh lebih tinggi berbanding subjenis kanser payudara yang lain. Tahap ITGA9 yang tinggi dikaitkan dengan metastasis tumor dan kambuh semula dalam pesakit TNBC. Pengecualian ITGA9 oleh CRISPR/Cas9 mengakibatkan sifat seperti sel stem kanser (CSC), angiogenesis tumor, pertumbuhan tumor, dan metastasis yang berkurangan dengan menggalakkan degradasi β-catenin dalam TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 ialah ahli keluarga TGF-β dan penting untuk embriogenesis awal, penyelenggaraan sel stem dan metastasis kanser (Ishii et al., 2021). Juga dikenali sebagai Tdgf-1, ia ialah protein isyarat berlabuh GPI onkogenik yang terlibat dalam pengawalaturan pembentukan coretan primitif, mesoderm dan endoderm, serta pembentukan asimetri kiri/kanan dalam perkembangan organ badan semasa embriogenesis (Zhang et al., 2021b). Selain itu, Cripto-1 telah terbukti terlibat dalam peralihan epitelium-mesenkim (EMT) sebagai penanda sel stem (Zhang et al., 2021b). EMT adalah penting bukan sahaja untuk pelbagai proses seperti perkembangan embrio, fibrosis dan penyembuhan luka, tetapi juga untuk pencerobohan dan metastasis kanser. Selain itu, Cripto-1 telah terbukti berinteraksi dengan empat reseptor Notch dan meningkatkan kematangan pasca-translasi mereka (Brandstadter dan Maillard, 2019). Laluan isyarat Notch diketahui terlibat dalam pengekalan sel kanser payudara manusia. Kajian telah menunjukkan bahawa knockout Crypto-1 yang dimediasi CRISPR/Cas9 menyekat pertumbuhan dan metastasis kanser. Oleh itu, Crypto-1 mungkin menjadi sasaran terapeutik penting untuk TNBC (Castro et al., 2015).
Protein XCL12 dan reseptor kemokinnya CXC (CXCR4 dan CXCR7) memainkan pelbagai peranan dalam percambahan, pertumbuhan, migrasi dan pencerobohan sel kanser (Wu et al., 2015). Kemoreseptor ini telah dikaitkan dengan perkembangan TNBC melalui pelbagai laluan isyarat dalam model in vivo dan in vitro (Wu et al., 2015). Di samping itu, pengaktifan CXCR4 dan CXCR7 dikaitkan dengan kerentanan yang lebih besar terhadap metastasis dan prognosis yang buruk dalam TNBC (Karn et al., 2022). Oleh itu, knockout CXCR4 dan CXCR7 mungkin menjadi gen sasaran ubat yang berkesan untuk rawatan kanser payudara, termasuk TNBC. Kajian oleh Yang et al. Yang et al (2019) menggunakan CRISPR/Cas9 untuk bersama-sama mengalahkan gen CXCR4 dan CXCR7 dan mendapati bahawa percambahan, pertumbuhan, migrasi dan pencerobohan TNBC telah dihalang dengan ketara (Yang et al., 2019).
Peningkatan tahap miR-3662, sejenis onkogen TNBC, diperhatikan dalam tisu kanser payudara (Yi et al., 2022). Penurunan miR-3662 telah terbukti menghalang pertumbuhan tumor kanser payudara dan metastasis secara in vivo dan in vitro (Agarwal dan Gupta, 2021). HBP-1 ialah perencat kuat bagi isyarat Wnt/-catenin dan berkemungkinan bertanggungjawab untuk pertumbuhan sel TNBC yang dimediasi miR-3662. Baru-baru ini, Yi et al. mendapati bahawa paksi miR-3662-HBP1 mengawal selia laluan isyarat Wnt/-catenin dalam sel TNBC (Yi et al., 2022). Disebabkan oleh ekspresi khusus tumornya, miR-3662 mungkin merupakan sasaran terapeutik yang berpotensi untuk TNBC. Oleh itu, penurunan miR-3662 yang dimediasi CRISPR/Cas9 mungkin merupakan pendekatan yang sangat baik untuk membangunkan ubat baharu untuk rawatan TNBC.
UBR5 ialah nukleofosfoprotein 300 kDa yang telah dikenal pasti sebagai pengawal selia utama tumorigenesis, metastasis dan tindak balas imun dalam pelbagai jenis kanser (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 telah dilaporkan sangat terkawal dalam sampel TNBC dan merangsang fungsi ERα dengan mendorong percambahan melalui aktiviti ligase ubiquitinnya (Bolt et al., 2015). Kajian penjujukan eksom keseluruhan sampel TNBC primer juga menunjukkan peningkatan ekspresi UBR5, menunjukkan peranannya dalam perkembangan TNBC. Selain itu, penghapusan UBR5 yang didorong oleh CRISPR/Cas9 menunjukkan perencatan metastasis TNBC dan pertumbuhan yang ketara dalam model tikus eksperimen. Selain itu, kemasukan UBR5 dalam model tikus jenis liar memulihkan fungsi penuhnya, manakala kesan ini tidak diperhatikan dalam strain mutan yang dinyahaktifkan (Liao et al., 2017). Kekurangan UBR5 dikaitkan dengan peningkatan apoptosis, nekrosis, dan perencatan pertumbuhan tumor dalam TNBC disebabkan oleh angiogenesis yang lemah. Disebabkan oleh kehilangan UBR5, penyebaran tumor ke organ yang jauh berkurangan, dan UBR5 mendorong EMT yang tidak normal terutamanya dengan mengurangkan ekspresi E-kadherin (Zhang dan Weinberg, 2018). Baru-baru ini, UBR5 telah ditunjukkan sebagai faktor yang sangat penting dalam transkripsi PDL1 yang disebabkan oleh IFN-γ dalam TNBC disebabkan oleh kekurangan aktiviti ubiquitination E3. Analisis transkriptom RNA mendedahkan bahawa UBR5 mungkin mempunyai kesan sistemik pada gen yang berkaitan dengan laluan IFN-γ dan menggalakkan transaktivasi PDL1 dengan meningkatkan tahap pengaktifan RNA kinase protein (PKR) dan transduser dan pengaktif isyaratnya. transkripsi 1 (STAT1) dan faktor pengawalseliaan interferon 1 (IRF1). Walau bagaimanapun, ablasi gabungan ekspresi UBR5 dan PD-L1 yang dimediasi CRISPR/Cas9 mempunyai kesan terapeutik sinergistik berbanding sekatan sahaja, dengan kesan yang mendalam terhadap persekitaran mikro tumor (Wu et al., 2022). Oleh itu, CRISPR/Cas9 mungkin merupakan alat penting untuk menghalang fungsi UBR5, sekali gus menyekat metastasis TNBC dan pertumbuhan tumor.
ROR1 ialah protein transmembran jenis I yang diekspresikan semasa perkembangan kanser dan embrio dan telah dikenal pasti sebagai protein onkofetal (Nicholas Borcherding, 2014). Tingkah laku invasif pelbagai kanser manusia dikaitkan dengan peningkatan regulasi ROR1. Keputusan yang memberangsangkan telah diperoleh daripada kajian in vivo dan in vitro yang melibatkan sebatian terapeutik yang menyasarkan ROR1 (Chien et al., 2016). Tahap mRNA ROR1 yang tinggi dalam biopsi tisu payudara juga telah dikaitkan dengan tumor payudara seperti basal (BL) yang agresif dan penghijrahannya ke bahagian lain badan. Selain itu, ekspresi berlebihan ROR1 telah dikenal pasti sebagai penanda prognostik untuk perkembangan TNBC (Chien et al., 2016). Walau bagaimanapun, membungkam ROR1 menggunakan CRISPR/Cas9 untuk menyekat pertumbuhan TNBC dan metastasis akan menjadi strategi yang berkesan.
Proses sialylation melibatkan penambahan asid sialik kepada glikokonjugat, yang dimangkinkan oleh sialiltransferase (ST). ST8SIA1 tergolong dalam keluarga ST dan memainkan peranan penting dalam patogenesis pelbagai penyakit seperti leukemia limfositik dan kanser kolorektal (Chang et al., 2018). Analisis urutan RNA menunjukkan bahawa ST8SIA1 diekspresikan dengan tinggi dalam tisu payudara pesakit TNBC dan berkorelasi positif dengan mutasi dalam gen penekan tumor p53, yang mungkin menyumbang kepada patogenesis TNBC (Battula et al., 2017). Di samping itu, ST8SIA1 terlibat dalam metastasis dan pengulangan TNBC, menunjukkan bahawa ia memainkan peranan penting dalam kejadian dan perkembangan TNBC. Dalam model in vitro TNBC, penurunan ST8SIA1 oleh CRIPSR/Cas9 terbukti menyekat pertumbuhan dan metastasis (Battula et al., 2017). Ini menunjukkan bahawa CRISPR/Cas9 mungkin merupakan alat penting untuk menghalang fungsi onkogen ST8SIA1 dalam rawatan TNBC.
NAT1 ialah enzim metabolik yang memangkinkan pembentukan sebatian xenobiotik fasa II dan diekspresikan dalam hampir semua tisu manusia. NAT1 boleh menggunakan kofaktor folat untuk menyasarkan asetil-CoA (asetil-CoA) walaupun tanpa substrat amina aromatik (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Kajian telah menunjukkan bahawa NAT1 mengawal fungsi matriks metalloproteinase 9 (MMP9) dalam model sel kanser payudara dan melindungi daripada spesies oksigen reaktif (ROS) semasa kebuluran glukosa (Wang et al., 2018). Pemadaman NAT1 telah terbukti menghalang kompleks piruvat dehidrogenase, yang membawa kepada disfungsi mitokondria (Wang L. et al., 2019). Selain itu, pelbagai laporan lain telah menunjukkan bahawa perencatan NAT1 menggunakan molekul kecil dan penyenyapan siRNA boleh mengurangkan invasif dan percambahan sel kanser payudara (Stepp et al., 2018). Baru-baru ini, CRISPR/Cas9 telah digunakan untuk menyekat NAT1 dalam barisan sel kanser payudara MDA-MB-231, yang mempengaruhi metabolisme selular bergantung pada tahap ekspresinya. Kajian ini juga menunjukkan bahawa NAT-1 adalah penting untuk perkembangan dan metastasis TNBC (Carlisle et al., 2020).
Transkripsi onkogen yang diselaraskan dikawal oleh superenhancer, faktor transkripsi dan kofaktor (Hnisz et al., 2015). Di samping itu, sekumpulan kinase yang bergantung kepada siklin (CDK), seperti CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, dan CDK13, diperlukan untuk pengawalaturan transkripsi. Antaranya, CDK7 terlibat dalam fosforilasi RNA polimerase II, yang sangat penting untuk permulaan dan pengembangan transkripsi onkogen dalam patogenesis TNBC. Dalam kajian penting, penghapusan CDK7 oleh CRISPR/Cas9 menghalang TNBC, menunjukkan bahawa patogenesis TNBC bergantung kepada CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Kajian telah menunjukkan bahawa mutasi dalam MYC dan RBP (protein pengikat RNA) boleh menyebabkan apoptosis, manakala mutasi gen tunggal dalam MYC atau RBP tidak menjejaskan pertumbuhan sel kanser (Einstein et al., 2021). Lebih daripada 1000 RBP dalam genom manusia telah ditapis menggunakan pustaka berasaskan CRISPR/Cas9. Antaranya, 57 RBP didapati kritikal untuk pertumbuhan sel kanser dengan tahap MYC yang sangat tinggi (Wheeler et al., 2020). Di samping itu, YTHDF2 adalah penting untuk mengekalkan pertumbuhan sel TNBC dan mengurangkan jumlah transkrip termetilasi semasa transkripsi dan terjemahan peringkat tinggi dalam sel kanser dengan ekspresi MYC yang lebih tinggi. Selain itu, YTHDF2 tidak penting untuk sel kanser, yang kurang bergantung pada tahap MYC yang tinggi untuk memanjangkan kelangsungan hidup pesakit TNBC (Einstein et al., 2021), menunjukkan bahawa ia mungkin merupakan sasaran terapeutik yang berpotensi untuk ubat-ubatan yang boleh mengatasi TNBC.
Protein jari zink (ZNF) membentuk kira-kira 1% daripada jumlah genom manusia. Kajian telah menunjukkan bahawa ZNF boleh mengawal selia percambahan sel dalam pelbagai jenis kanser, seperti kanser hati, kanser payudara dan kanser kolorektal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Perpustakaan yang dihasilkan oleh knockout CRISPR telah digunakan untuk menyaring pelbagai gen penekan tumor (TSG) dalam sel kanser payudara (Shalem et al., 2014). Sejak itu, kajian transkriptomik sel kanser payudara yang dipadamkan oleh CRISPR/Cas9 ZNF319 telah menunjukkan bahawa ZNF319 ialah gen penekan tumor yang mengurangkan percambahan kanser payudara dan oleh itu terlibat dalam pelbagai mekanisme isyarat yang berpotensi dan fungsi biologi lain (Wang L. et al., 2022).
Ferroptosis ialah sejenis kematian sel terprogram yang bergantung kepada kehadiran zat besi. Telah diketahui bahawa perkembangan ferroptosis dipengaruhi oleh kehadiran peroksida lipid. Di samping itu, PKCβII telah dilaporkan menunjukkan peroksidaan lipid awal, dan peningkatan peroksidaan lipid dikaitkan dengan ferroptosis. Pemeriksaan perpustakaan perencat kinase yang dimediasi CRISPR/Cas9 mendedahkan bahawa PKCβII terlibat dalam proses peroksidaan lipid, yang penting untuk ferroptosis dalam sel MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Oleh itu, ini menunjukkan bahawa knockout PKCβII oleh CRISPR/Cas9 mungkin merupakan sasaran gen penindas tumor yang berpotensi untuk rawatan penyakit berkaitan ferroptosis (Zhang et al., 2022).
Rintangan ubat dipercayai bertanggungjawab untuk kira-kira 90% kematian pesakit kanser dan merupakan salah satu cabaran utama dalam rawatan kanser (Bukowski et al., 2020). Keputusan menunjukkan bahawa bilangan gen yang mencukupi yang berkaitan dengan pengaliran ubat, pembaikan DNA, apoptosis dan pelbagai laluan isyarat sel dikaitkan dengan rintangan ubat (Haider et al., 2020). Antaranya, beberapa gen telah disasarkan oleh alat CRISPR/Cas9 dan telah menunjukkan hasil yang memberangsangkan dalam mengurangkan rintangan ubat dan meningkatkan keberkesanan rawatan anti-kanser (Vaghari-Tabari et al., 2022). Di samping itu, perpustakaan saringan kalah mati gen CRISPR/Cas9 berdaya pemprosesan tinggi telah dikaitkan dalam mengubah suai fungsi sasaran gen rintangan ubat yang berpotensi (Shalem et al., 2015). Untuk mengenal pasti gen rintangan paclitaxel, penjujukan RNA yang digandingkan dengan saringan pustaka sgRNA seluruh genom telah digunakan untuk mengenal pasti lapan gen calon, termasuk histon deasetilase 9 (HDAC9), yang dikaitkan dengan rintangan ubat pada pesakit dengan TNBC berulang (B et al., 2020). Dalam satu lagi kajian, peningkatan ekspresi diserina/treonina dan protein kinase tirosin (DSTYK) diperhatikan semasa pesakit TNBC yang dirawat dengan ubat antikanser. Selain itu, penurunan DSTYK yang dimediasi CRISPR/Cas9 meningkatkan apoptosis sel kanser tahan ubat dengan ketara secara in vitro (sel SUM102PT dan sel MDA-MB-468) dan model TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Walaupun TNBC mempunyai pengaktifan laluan MAPK yang tidak normal, kesan klinikal terapi yang disasarkan MEK adalah lemah. Saringan pustaka genomik CRISPR/Cas9 mendedahkan bahawa perencatan PSMG2 (pengiring pemasangan proteom 2) menyesensitifkan sel TNBC BT549 dan MB468 kepada perencat MEK AZD6244. Penurunan CRISPR/Cas9 PSMG2 mengubah fungsi proteasom normal, yang membawa kepada pembongkaran PDPK1 yang dimediasi autofagi, sekali gus meningkatkan lagi sel tumor dalam model tikus TNBC yang diinduksi oleh AZD6244 (perencat MEK) dan MG132 (perencat proteasosom). Oleh itu, perencat proteasosom dan MAP kinase (MEK) boleh diberikan secara sinergi untuk mengurangkan percambahan sel tumor (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 juga telah digunakan untuk menyaring kehilangan fungsi gen yang membawa kepada rintangan TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al menjelaskan mekanisme rintangan ubat sel kanser yang dirawat dengan JQ1, perencat bromodomain BET (BBDI), dalam TNBC. Menggunakan CRISPR/Cas9, mereka mendapati bahawa penghapusan gen rb1 menyebabkan TNBC menjadi tahan terhadap ubat anti-kanser JQ1. Oleh itu, fungsi rb1 adalah penting dalam tindak balas terhadap ubat JQ1 dalam TNBC. Mereka juga melaporkan bahawa paclitaxel adalah perencat kinase/mikrotubul CDK4/6, dan gabungannya dengan BBDI seperti JQ1 mungkin memberikan tindak balas terapeutik yang menjanjikan terhadap TNBC yang tahan ubat (Ge et al., 2020).
Landskap transkripsi RNA bukan pengekodan panjang (lncRNA) telah dilaporkan bertanggungjawab terhadap rintangan terhadap terapi neoadjuvan dalam TNBC. Kajian ini menunjukkan bahawa lima transkrip lncRNA MALAT1 yang berbeza diekspresikan dengan tinggi dalam TNBC. Selain itu, penghapusan MALAT1 yang dimediasi CRISPR/Cas9 meningkatkan kepekaan sel TNBC BT-549 terhadap paclitaxel dan doxorubicin, menunjukkan peranan yang berpotensi untuk rintangan MALAT1 dalam TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutasi dalam BRCA1 (BRCA1m) adalah heterogen dan oleh itu sukar untuk dikesan. Menyasarkan PARP1 (poli(ADP-ribose) polimerase), pasangan maut sintetik BRCA1, boleh meningkatkan kemosensitiviti ubat TNBC. Menggunakan CRISPR/Cas9, penghapusan PARP1 meningkatkan sensitiviti ubat antikanser seperti doxorubicin, gemcitabine dan docetaxel terhadap sel TNBC mutan mBRCA1, menunjukkan bahawa PARP1 juga terlibat dalam rintangan ubat dalam TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutasi dalam gen penekan tumor BRCA1 atau BRCA2 diketahui meningkatkan kemungkinan menghidap kanser payudara pada orang ramai. Rawatan pesakit ini memerlukan penggunaan perencat PARP. Selain itu, telah ditunjukkan bahawa pemusnahan faktor penyelamat nukleotida DNPH1 menggunakan CRISPR/Cas9 boleh menyingkirkan nukleotida 5-hidroksimetildeoksiuridina (hmdU) monofosfat toksik, sekali gus meningkatkan tindak balas sel kekurangan BRCA terhadap kepekaan terhadap perencat PARP (Fugger). et al., 2021). Oleh itu, perencat CRISPR/Cas9 dan PARP1 boleh menjadi strategi rawatan penting untuk TNBC.
Gen glikoprotein penembus (P-gp) ialah gen rintangan pelbagai ubat yang secara amnya dikawal selia secara meningkat dalam kira-kira 41% daripada semua TNBC (Sun et al., 2020). Pengaliran keluar ubat yang disebabkan oleh P-gp telah dikenal pasti sebagai pengawal selia utama rintangan ubat dalam kanser payudara. Perencat P-gp telah menunjukkan peningkatan kepekaan terhadap ubat antikanser dalam kanser payudara (Famta et al., 2021). Oleh itu, ablasi atau penindasan perencat P-gp dan P-gp yang dimediasi CRISPR/Cas9 mungkin merupakan kaedah yang sangat penting untuk mengatasi rintangan ubat dalam TNBC.
Pengangkut kaset pengikat ATP G2 (ABCG2) diketahui menyebabkan rintangan ubat dalam TNBC (Palasuberniam et al., 2015), walaupun pada masa ini tiada laporan mengenai hubungan antara pembungkaman CRISPR/Cas9 dan ABCG2 serta penyahaktifan gen penindas tumor. PTEN Boleh meningkatkan pengaktifan ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Oleh itu, penggunaan CRISP/Ca9 untuk membuang ABCG2 dan menggabungkannya dengan perencat ABCG2 mungkin merupakan rawatan yang sesuai untuk mengatasi rintangan ubat dalam TNBC. Jadual 2 menyebut CRISPR/Cas9 yang mensasarkan semua gen rintangan.
Jadual 2. CRISPR/Cas9 mensasarkan pelbagai gen rintangan TNBC untuk menyesensiaikan sel terhadap ubat antikanser.
Perpustakaan CRISPR/Cas9 merupakan alat yang berpotensi untuk menyaring mutasi gen yang berkaitan dengan patogenesis kanser (Chan et al., 2022). Kaedah saringan ini melibatkan empat langkah seperti (a) pembinaan perpustakaan, (b) transduksi lentiviral, (c) saringan fenotip dan (d) analisis gen sasaran. Walaupun TNBC mempunyai pengaktifan laluan MAPK yang tidak normal, prognosis klinikal terapi sasaran MEK untuk pesakit TNBC yang membawa mutasi dalam gen penekan tumor seperti PTEN, RB1 dan TP53 adalah sangat buruk.
Selain itu, saringan kalah mati gen menggunakan CRISPR/Cas9 telah menguji molekul yang paling kuat dan selektif, dehidrokatrol, yang banyak terdapat dalam ekstrak bunga dan daun Guatemala, untuk memahami kesan dehidrokatrol pada MDA-MB-231. Mekanisme sitotoksisiti sel selektif. Ciri-ciri ketangkasan mesenkimal subjenis TNBC. Saringan berasaskan CRISPR/Cas9 ini juga mendedahkan bahawa HSD17B11, gen yang mengekod 17β-hidroksisteroid dehidrogenase jenis 11, diekspresikan dengan tinggi dalam sel MDA-MB-231 dan menghasilkan dehidrofalkarinol khusus untuk sel MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Oleh itu, ini menunjukkan bahawa saringan genomik CRISPR/Cas9 mempunyai potensi besar dalam mengenal pasti mekanisme yang mendasari sifat antikanser sebatian semula jadi yang berpotensi.
Di samping itu, kerentanan TNBC terhadap kanser telah dikaji menggunakan saringan CRISPR/Cas9 in vivo seluruh genom yang tidak berat sebelah, yang menunjukkan hubungan antara laluan onkogenik dan penekan tumor. Komponen utama laluan mTOR dan Hippo telah dilaporkan memainkan peranan penting dalam pengawalaturan tumor dalam TNBC. Selain itu, kajian telah menunjukkan bahawa perencatan farmakologi onkoprotein mTORC1/2 dan YAP berkesan menghalang patogenisiti TNBC menggunakan model sinergi matriks ubat in vitro dan xenograf yang diperoleh pesakit in vivo. Selain itu, perencatan mTORC1/2 yang dimediasi Torin-1 meningkatkan makropinositosis, manakala perencatan YAP yang disebabkan oleh verteporfin membawa kepada kematian sel TNBC. Secara keseluruhan, keputusan ini menonjolkan kuasa dan keteguhan saringan CRISPR in vivo seluruh genom untuk mengenal pasti rawatan baharu dan berkesan untuk TNBC (Dai et al., 2021).
Disregulasi sistem imun merupakan faktor penting dalam tumorigenesis. Sel-sel kanser mengelak daripada pembersihan imun dengan memintas mekanisme pertahanan, termasuk mengganggu aktiviti sel imun dalam persekitaran mikro tumor dan menjejaskan sistem imun. Oleh itu, membangunkan sistem imun yang lebih baik mungkin merupakan pendekatan utama untuk melawan tumor. Penggunaan pengubahsuaian gen berasaskan CRISPR/Cas9 menangani beberapa isu yang berkaitan dengan disfungsi imun dari perspektif yang berbeza. CRISPR/Cas9 telah digunakan untuk meningkatkan imuniti antitumor terhadap kanser payudara melalui laluan berikut (Rajah 3).
Rajah 3. Imunoterapi CRISPR/Cas9 menyasarkan sel TNBC. Kehilangan CDK5 dan penurunan PDL1 dan CD155 meningkatkan sistem imun. Begitu juga, kehilangan A2AR dan penurunan TAA seperti HER2, mucin 1 dan TEM8 meningkatkan kecekapan sel CAR-T dalam membunuh sel kanser. Saringan sel T yang dipacu CRISPR/Cas9 telah menunjukkan bahawa gangguan kinase p38 meningkatkan aktiviti antitumor sel T. Sel T yang diubah suai oleh CRISPR/Cas9 meningkatkan ekspresi TCR (reseptor sel T), mengakibatkan sel T mempunyai aktiviti antitumor.
Matlamat imunoterapi adalah untuk merangsang sistem imun untuk menyerang sel-sel kanser. Ekspresi berlebihan protein titik semak imun biasanya menghalang reaksi autoimun tetapi boleh membantu kanser mengelakkannya (Topalian et al., 2015). Protein ini menghalang reaksi imun dengan mengikat reseptor pada permukaan sel imun. Pelbagai protein titik semak (seperti CD155 dan PD-L1) menyasarkan reseptor PD-1 pada sel imun dan diekspresikan dalam kanser payudara, terutamanya TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Pengecutan PD-L1 atau reseptornya menggunakan CRISPR/Cas9 boleh merangsang sistem imun untuk menyerang tumor TNBC (Yahata et al., 2019). Selain itu, penurunan regulasi ekspresi PD-L1 melalui penghapusan CDK5 yang dimediasi CRISPR/Cas9 telah terbukti menghalang pertumbuhan tumor secara in vitro dan in vivo (Deng et al., 2020). Perencatan pertumbuhan dalam model in vitro dan in vivo kanser payudara menunjukkan bahawa pengurangan CD155 yang dimediasi shRNA mungkin mempunyai kesan terapeutik terhadap kanser payudara (Gao et al., 2018).
Sel T CAR mengekspresikan CAR yang mengenali antigen berkaitan tumor (TAA) dan boleh menggunakan penurunan protein titik semak untuk meningkatkan aktivitinya (Li C. et al., 2020). Terdapat pelbagai sasaran berpotensi untuk terapi sel T CAR dalam kanser payudara, termasuk beberapa TAA seperti HER2, mucin1, dan TEM8 (Bajgain et al., 2018). Terdapat bukti bahawa sel T CAR yang menyasarkan mesothelin (terlebih ekspresi dalam sel TNBC BT-459) lebih berkesan terhadap kanser apabila PD-1 disingkirkan menggunakan CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Walau bagaimanapun, mengasingkan sel T daripada pesakit dan kemudian mengeditnya secara ex vivo adalah proses yang memerlukan tenaga kerja dan memakan masa. Walaupun sel T universal dapat mengurangkan keperluan pengasingan, sel T penderma yang mengekspresikan antigen leukosit manusia (HLA) kelas I dan reseptor sel T (TCR) harus dikeluarkan untuk mencegah keabnormalan graft-versus-host (Ren et al., 2017)., 2017a). Menggunakan CRISPR/Cas9, HDR boleh menghapuskan TCR dan HLA secara serentak dan menyingkirkan pengekodan gen CAR. Kajian telah menunjukkan bahawa CRISPR/Cas9 boleh digunakan untuk memperkenalkan CAR anti-CD19 ke dalam lokus TCR, sekali gus menghasilkan CAR dengan cekap tanpa mengurangkan sel T (Dimitri et al., 2022). Teknologi multipleks telah dibangunkan untuk menjana sel T CAR alogenik dengan menghapuskan TCR, beta-2-mikroglobulin (B2M), subunit HLA-I dan protein lain seperti PD-1 dan CTLA-4 secara serentak, yang mungkin mempunyai ciri-ciri anti-kanser yang lebih besar terhadap TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Penggunaan CRISPR/Cas9 boleh meningkatkan keberkesanan sel CAR-T. Adenosina diketahui mempunyai sifat imunosupresif dan boleh mengurangkan imuniti antikanser dengan menyekat fungsi sel T dan mengaktifkan reseptor adenosina A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Menyenyapkan A2AR menggunakan CRISPR/Cas9 meningkatkan keberkesanan sel CAR-T secara in vivo dengan ketara (Giuffrida et al., 2021). Sel T diketahui mempamerkan pelbagai ciri fenotip seperti pengembangan selular, pembezaan, tekanan oksidatif dan tekanan genomik. Saringan sel T berasaskan CRISPR/Cas9 mendedahkan gangguan 25 kinase reseptor sel T yang berbeza. Antaranya, penghapusan kinase p38 telah terbukti dapat meningkatkan aktiviti antitumor sel T, menunjukkan bahawa kinase p38 merupakan pengawal selia utama pengawalaturan sel CAR-T (Gurasamy et al., 2020).
Sel T boleh diubah suai secara genetik menggunakan CRISPR/Cas9 untuk menghasilkan TCR yang diekspresikan dengan tinggi. Pemindahan sel T yang diubah suai secara genetik kepada pesakit telah menunjukkan aktiviti antikanser yang lebih kuat daripada sel T endogen. Oleh itu, TCR endogen mungkin bersaing dengan TCR yang diubah suai secara genetik pada pesakit, yang mungkin memberi kesan kepada potensi imunoterapi kanser. Untuk mengatasi masalah ini, penggunaan CRISPR/Cas9 untuk membuang TCR-β endogen dalam sel penerima dan seterusnya memindahkan sel T TCR-β kepada pesakit kanser mungkin menunjukkan tindak balas imun antikanser yang lebih baik tanpa memerlukan persaingan seksual TCR endogen (Fan et al. 2018). Oleh itu, kecuali sel T yang diubah suai CRISPR, TCR adalah seribu kali lebih sensitif terhadap antigen tumor daripada sel T yang ditransduksi TCR biasa. Selain itu, dalam pelbagai leukemia, sel T yang diubah suai yang dihasilkan oleh γδ TCR+ CRISPR mempamerkan ekspresi sel T CD4+ dan CD8+ yang lebih tinggi daripada pemindahan TCR standard (Legut et al., 2018). Oleh itu, sel T yang diubah suai yang dihasilkan oleh CRISPR/Cas9 mungkin merupakan kaedah imunoterapi yang berkesan untuk mengatasi TNBC.
Integrin ialah molekul lekatan sel yang terdapat dalam transmembran selular dan menggalakkan pengikatan sel pada matriks ekstraselular (ECM) (Hamidi dan Ivaska, 2018). Disregulasi integrin dikaitkan dengan perkembangan dan penghijrahan kanser dengan mengubah matriks ekstraselular, yang membawa kepada kemandirian sel kanser dalam peredaran (Hamidi dan Ivaska, 2018). Pengetatan integrin yang dimediasi CRISPR/Cas9 memperlahankan perkembangan tumor, metastasis dan penjajahan dalam TNBC. Pengetatan integrin a5 (ITGA5) telah dilaporkan dapat mengurangkan penghijrahan dan perkembangan sel dalam kanser lain seperti kanser paru-paru (Ju et al., 2017), menunjukkan bahawa integrin a5 juga mungkin merupakan faktor utama dalam patogenesis TNBC.
Menjana tikus knockout menggunakan kaedah sel stem embrio (ES) tradisional merupakan proses yang memerlukan tenaga kerja yang banyak, memakan masa, dan tidak cekap. Ia mengambil masa berbulan-bulan dan bertahun-tahun untuk menyasarkan sel ES melalui penggabungan semula homolog, membiakkan tikus kimerik, dan kemudian mengacukannya dengan tikus heterozigot untuk menghasilkan anak homozigot. Kacukan silang kompleks diperlukan untuk mencipta tikus dengan pelbagai mutasi genetik. Walau bagaimanapun, banyak masalah telah timbul apabila menggunakan tikus yang dihasilkan melalui ablasi sel ES menggunakan CRISPR/Cas9 atau dengan menyuntik mikro komponen CRISPR/Cas9 ke dalam telur yang disenyawakan sel tunggal. Contohnya, pengenalan perubahan sering berlaku pada lokus biallelik dan bukan khusus gen. Baru-baru ini dilaporkan bahawa sel ES yang menggunakan teknologi CRISPR/Cas9 boleh memasukkan mutasi biallelik secara serentak dalam sehingga 5 gen (Nishizono et al., 2021). Untuk tujuan ini, mRNA Cas9 dan lima gRNA khusus gen telah ditransfeksi secara serentak ke dalam sel ES. Ini menonjolkan janji dan keberkesanan prosedur ini, walaupun mutasi ini mungkin telah diwarisi apabila keturunan pengasas dibiakkan untuk menghasilkan tikus knockout lima kali ganda. Kajian ini juga melaporkan penemuan yang mengejutkan: Sel ES tidak lagi diperlukan untuk mencipta tikus yang diubah suai secara genetik. Sebaliknya, untuk membuang produk gen tertentu, mRNA dan gRNA Cas9 telah disuntik ke dalam embrio peringkat sel tunggal. Hasilnya, keturunan pengasas knockout telah dicipta yang secara teorinya boleh digunakan untuk mengkaji akibat pemadaman gen pada tikus (Qin et al., 2016). Oleh itu, CRISPR/Cas9 membolehkan penciptaan tikus transgenik untuk merawat TNBC pada kos yang lebih rendah daripada kejuruteraan genetik tradisional. Menggunakan sistem CRISPR/Cas, model tikus knockout baharu telah dibangunkan yang berjaya memperkenalkan mutasi titik dalam satu atau lebih gen endogen dalam TNBC. Berdasarkan konsep ini, model haiwan TNBC juga boleh dibangunkan menggunakan penghapusan BRCA1 dan p53 yang dimediasi CRISPR/Cas9, mengakibatkan kehilangan pembaikan HR, ketidakstabilan genomik dan fenotip mutan (Annunziato et al., 2020).
Pada masa ini, pelbagai kaedah seperti mamografi, pengimejan resonans magnetik (MRI) dan ultrasound digunakan untuk mendiagnosis TNBC. Walau bagaimanapun, kaedah ini mempunyai beberapa batasan. Mamografi digunakan untuk mendiagnosis tisu payudara tempatan dan bukannya metastasis, di mana sel-sel kanser telah berhijrah ke organ lain. Ultrasonografi bukanlah kaedah yang boleh dipercayai untuk mendiagnosis TNBC (Chen dan Lee-Felker, 2023). MRI mempunyai sensitiviti yang lebih tinggi daripada ultrasound dan mamografi, tetapi ketepatan diagnostiknya terhad (Sha dan Chen, 2022). Biopsi tisu adalah cara invasif untuk mengenal pasti sel-sel kanser. Walau bagaimanapun, dalam beberapa kes, biopsi mungkin terlepas tisu kanser jika jarum menyimpang dari kawasan yang diminati. Di samping itu, ia sangat mahal dan boleh menjadi traumatik bagi pesakit. TNBC adalah sejenis kanser yang heterogen, jadi biopsi mungkin tidak memberikan maklumat yang mencukupi tentang jenis kanser. Oleh itu, kaedah diagnostik baharu yang boleh dipercayai untuk mengesan TNBC amat diperlukan. CRISPR/Cas9 boleh berfungsi sebagai alternatif yang sangat sensitif dan minimum invasif untuk diagnosis kanser payudara. Untuk tujuan ini, strategi berasaskan CRISPR/Cas9 boleh digunakan untuk menambah baik kaedah PCR bagi diagnosis TNBC. Pertama, protein Cas9 dan cpf1 sistem CRISPR digunakan untuk membuang DNA bukan spesifik, dan kemudian kedua-dua protein ini (Cas9 dan cpf1) boleh mengenali urutan PAM sebelum mengikat pada DNA sasaran (Deepak Singh et al., 2021). Oleh itu, PCR boleh mengenal pasti mutasi yang berkaitan dengan perkembangan kanser. Beberapa kajian telah menggunakan strategi berasaskan CRISPR ini untuk mengesan mutasi yang berbeza dalam kanser yang berbeza (Safari et al., 2019). Oleh itu, kaedah PCR berasaskan CRISPR boleh mengurangkan pergantungan diagnosis TNBC pada kaedah invasif seperti imunohistokimia berasaskan biopsi.
Perubahan genotip dalam pengawalaturan reseptor hormon juga telah ditunjukkan dalam TNBC (Chen dan Russo, 2009). Strategi PCR berasaskan CRISPR/Cas9 yang menggunakan mikroarray untuk diagnostik di tempat rawatan boleh memantau mutasi ini dengan berkesan (Hajian et al., 2019). Ia juga boleh menyediakan penyedia penjagaan kesihatan dengan maklumat yang berkaitan tentang mutasi khusus pada pesakit TNBC, yang boleh membantu menambah baik perjalanan rawatan mereka. Walau bagaimanapun, teknik gabungan ini mempunyai batasan. Oleh itu, usaha penyelidikan yang meluas diperlukan sebelum kaedah CRISPR/Cas-PCR ini boleh digunakan dalam penjagaan kesihatan untuk diagnosis TNBC (Yang et al., 2019).