Diagnosis pembezaan nodul pulmonari yang dikenal pasti oleh tomografi berkomputer (CT) kekal sebagai cabaran dalam amalan klinikal.Di sini, kami mencirikan metabolom global 480 sampel serum, termasuk kawalan sihat, nodul paru-paru jinak, dan adenokarsinoma paru-paru peringkat I.Adenokarsinoma mempamerkan profil metabolomik yang unik, manakala nodul benigna dan individu yang sihat mempunyai persamaan yang tinggi dalam profil metabolomik.Dalam kumpulan penemuan (n = 306), satu set 27 metabolit telah dikenalpasti untuk membezakan antara nodul benigna dan malignan.AUC bagi model diskriminasi dalam kumpulan pengesahan dalaman (n = 104) dan pengesahan luaran (n = 111) ialah 0.915 dan 0.945.Analisis laluan mendedahkan peningkatan metabolit glikolitik yang dikaitkan dengan penurunan triptofan dalam serum adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan nodul benigna dan kawalan sihat, dan mencadangkan bahawa pengambilan tryptophan menggalakkan glikolisis dalam sel-sel kanser paru-paru.Kajian kami menyerlahkan nilai biomarker metabolit serum dalam menilai risiko nodul pulmonari yang dikesan oleh CT.
Diagnosis awal adalah penting untuk meningkatkan kadar kelangsungan hidup pesakit kanser.Keputusan daripada Percubaan Saringan Kanser Paru-paru Kebangsaan AS (NLST) dan Kajian NELSON Eropah telah menunjukkan bahawa pemeriksaan dengan tomografi pengiraan dos rendah (LDCT) boleh mengurangkan dengan ketara kematian kanser paru-paru dalam kumpulan berisiko tinggi1,2,3.Sejak penggunaan LDCT secara meluas untuk pemeriksaan kanser paru-paru, kejadian penemuan radiografi sampingan nodul pulmonari asimtomatik terus meningkat 4 .Nodul pulmonari ditakrifkan sebagai kelegapan fokus sehingga 3 cm diameter 5 .Kami menghadapi kesukaran dalam menilai kemungkinan keganasan dan menangani sejumlah besar nodul pulmonari yang dikesan secara kebetulan pada LDCT.Had CT boleh membawa kepada pemeriksaan susulan yang kerap dan keputusan positif palsu, yang membawa kepada campur tangan yang tidak perlu dan rawatan yang berlebihan6.Oleh itu, terdapat keperluan untuk membangunkan biomarker yang boleh dipercayai dan berguna untuk mengenal pasti kanser paru-paru dengan betul pada peringkat awal dan membezakan kebanyakan nodul jinak pada pengesanan awal 7 .
Analisis molekul darah yang komprehensif (serum, plasma, sel mononuklear darah periferal), termasuk genomik, proteomik atau metilasi DNA8,9,10, telah menyebabkan minat yang semakin meningkat dalam penemuan biomarker diagnostik untuk kanser paru-paru.Sementara itu, pendekatan metabolomik mengukur produk akhir selular yang dipengaruhi oleh tindakan endogen dan eksogen dan oleh itu digunakan untuk meramalkan permulaan dan hasil penyakit.Spektrometri jisim tandem kromatografi cecair (LC-MS) ialah kaedah yang digunakan secara meluas untuk kajian metabolomik kerana sensitivitinya yang tinggi dan julat dinamik yang besar, yang boleh meliputi metabolit dengan sifat fizikokimia yang berbeza11,12,13.Walaupun analisis metabolomik global plasma/serum telah digunakan untuk mengenal pasti biomarker yang dikaitkan dengan diagnosis kanser paru-paru14,15,16,17 dan keberkesanan rawatan, pengelas metabolit 18 serum untuk membezakan antara nodul paru-paru jinak dan malignan masih banyak dikaji.-penyelidikan besar-besaran.
Adenokarsinoma dan karsinoma sel skuamosa adalah dua subtipe utama kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC).Pelbagai ujian saringan CT menunjukkan bahawa adenokarsinoma adalah jenis histologi kanser paru-paru yang paling biasa1,19,20,21.Dalam kajian ini, kami menggunakan spektrometri jisim resolusi tinggi kromatografi cecair berprestasi ultra (UPLC-HRMS) untuk melakukan analisis metabolomik pada sejumlah 695 sampel serum, termasuk kawalan sihat, nodul pulmonari jinak, dan dikesan CT ≤3 cm.Pemeriksaan untuk adenokarsinoma paru-paru Tahap I.Kami mengenal pasti panel metabolit serum yang membezakan adenokarsinoma paru-paru daripada nodul benigna dan kawalan yang sihat.Analisis pengayaan laluan mendedahkan bahawa metabolisme triptofan dan glukosa yang tidak normal adalah perubahan biasa dalam adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan nodul benigna dan kawalan yang sihat.Akhirnya, kami menubuhkan dan mengesahkan pengelas metabolik serum dengan kekhususan dan kepekaan yang tinggi untuk membezakan antara nodul pulmonari malignan dan jinak yang dikesan oleh LDCT, yang boleh membantu dalam diagnosis pembezaan awal dan penilaian risiko.
Dalam kajian semasa, sampel serum yang dipadankan dengan jantina dan umur telah dikumpulkan secara retrospektif daripada 174 kawalan sihat, 292 pesakit dengan nodul pulmonari benigna, dan 229 pesakit dengan adenokarsinoma paru-paru peringkat I.Ciri demografi 695 subjek ditunjukkan dalam Jadual Tambahan 1.
Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1a, sejumlah 480 sampel serum, termasuk 174 kawalan sihat (HC), 170 nodul benigna (BN), dan 136 sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) peringkat I, telah dikumpulkan di Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen.Kohort penemuan untuk pemprofilan metabolomik tidak disasarkan menggunakan spektrometri jisim resolusi tinggi kromatografi cecair berprestasi ultra (UPLC-HRMS).Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 1, metabolit pembezaan antara LA dan HC, LA dan BN telah dikenal pasti untuk mewujudkan model klasifikasi dan meneroka analisis laluan pembezaan.104 sampel yang dikumpul oleh Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen dan 111 sampel yang dikumpul oleh dua hospital lain masing-masing tertakluk kepada pengesahan dalaman dan luaran.
Populasi kajian dalam kohort penemuan yang menjalani analisis metabolomik serum global menggunakan spektrometri jisim resolusi tinggi kromatografi cecair berprestasi tinggi (UPLC-HRMS).b Analisis diskriminasi kuasa dua terkecil separa (PLS-DA) daripada jumlah metabolom 480 sampel serum daripada kohort kajian, termasuk kawalan sihat (HC, n = 174), nodul benigna (BN, n = 170), dan adenokarsinoma paru-paru peringkat I (Los Angeles, n = 136).+ESI, mod pengionan elektrospray positif, -ESI, mod pengionan elektrospray negatif.c–e Metabolit dengan kelimpahan yang ketara berbeza dalam dua kumpulan tertentu (ujian pangkat Wilcoxon dua ekor, nilai p terlaras kadar penemuan palsu, FDR <0.05) ditunjukkan dalam warna merah (perubahan kali ganda > 1.2) dan biru (perubahan kali ganda < 0.83) .) ditunjukkan pada grafik gunung berapi.f Peta haba pengelompokan hierarki menunjukkan perbezaan ketara dalam bilangan metabolit beranotasi antara LA dan BN.Data sumber disediakan dalam bentuk fail data sumber.
Jumlah metabolom serum 174 HC, 170 BN dan 136 LA dalam kumpulan penemuan dianalisis menggunakan analisis UPLC-HRMS.Kami mula-mula menunjukkan bahawa sampel kawalan kualiti (QC) berkelompok ketat di tengah-tengah model analisis komponen utama (PCA) yang tidak diselia, mengesahkan kestabilan prestasi kajian semasa (Tambahan Rajah 2).
Seperti yang ditunjukkan dalam analisis diskriminasi kuasa dua terkecil separa (PLS-DA) dalam Rajah 1 b, kami mendapati terdapat perbezaan yang jelas antara LA dan BN, LA dan HC dalam mod pengionan elektrospray positif (+ESI) dan negatif (-ESI). .terpencil.Walau bagaimanapun, tiada perbezaan ketara ditemui antara BN dan HC dalam keadaan +ESI dan -ESI.
Kami mendapati 382 ciri pembezaan antara LA dan HC, 231 ciri pembezaan antara LA dan BN, dan 95 ciri pembezaan antara BN dan HC (ujian pangkat yang ditandatangani Wilcoxon, FDR <0.05 dan perubahan berganda >1.2 atau <0.83) (Rajah .1c-e )..Puncak telah diberi anotasi selanjutnya (Data Tambahan 3) terhadap pangkalan data (perpustakaan mzCloud/HMDB/Chemspider) mengikut nilai m/z, masa pengekalan dan carian spektrum jisim pemecahan (butiran yang diterangkan dalam bahagian Kaedah) 22 .Akhirnya, 33 dan 38 metabolit beranotasi dengan perbezaan ketara dalam kelimpahan telah dikenal pasti untuk LA berbanding BN (Rajah 1f dan Jadual Tambahan 2) dan LA berbanding HC (Rajah Tambahan 3 dan Jadual Tambahan 2), masing-masing.Sebaliknya, hanya 3 metabolit dengan perbezaan ketara dalam kelimpahan dikenal pasti dalam BN dan HC (Jadual Tambahan 2), selaras dengan pertindihan antara BN dan HC dalam PLS-DA.Metabolit pembezaan ini meliputi pelbagai jenis biokimia (Tambahan Rajah 4).Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan perubahan ketara dalam metabolom serum yang mencerminkan transformasi malignan kanser paru-paru peringkat awal berbanding dengan nodul paru-paru jinak atau subjek yang sihat.Sementara itu, persamaan metabolom serum BN dan HC menunjukkan bahawa nodul pulmonari benigna mungkin berkongsi banyak ciri biologi dengan individu yang sihat.Memandangkan mutasi gen reseptor faktor pertumbuhan epidermis (EGFR) adalah perkara biasa dalam subjenis adenokarsinoma paru-paru 23, kami berusaha untuk menentukan kesan mutasi pemandu pada metabolom serum.Kami kemudian menganalisis profil metabolomik keseluruhan 72 kes dengan status EGFR dalam kumpulan adenokarsinoma paru-paru.Menariknya, kami mendapati profil setanding antara pesakit mutan EGFR (n = 41) dan pesakit jenis liar EGFR (n = 31) dalam analisis PCA (Tambahan Rajah 5a).Walau bagaimanapun, kami mengenal pasti 7 metabolit yang banyaknya telah diubah dengan ketara pada pesakit dengan mutasi EGFR berbanding pesakit dengan EGFR jenis liar (ujian t, p <0.05 dan perubahan kali ganda> 1.2 atau <0.83) (Tambahan Rajah 5b).Majoriti metabolit ini (5 daripada 7) adalah acylcarnitines, yang memainkan peranan penting dalam laluan pengoksidaan asid lemak.
Seperti yang digambarkan dalam aliran kerja yang ditunjukkan dalam Rajah 2 a, biomarker untuk pengelasan nodul diperoleh menggunakan operator pengecutan mutlak terkecil dan pemilihan berdasarkan 33 metabolit pembezaan yang dikenal pasti dalam LA (n = 136) dan BN (n = 170).Gabungan pembolehubah terbaik (LASSO) – model regresi logistik binari.Pengesahan silang sepuluh kali ganda digunakan untuk menguji kebolehpercayaan model.Pemilihan pembolehubah dan penyelarasan parameter diselaraskan dengan penalti pemaksimuman kemungkinan dengan parameter λ24.Analisis metabolomik global selanjutnya dilakukan secara bebas dalam kumpulan pengesahan dalaman (n = 104) dan pengesahan luaran (n = 111) untuk menguji prestasi klasifikasi model diskriminan.Hasilnya, 27 metabolit dalam set penemuan dikenal pasti sebagai model diskriminasi terbaik dengan nilai purata AUC terbesar (Rajah 2b), antaranya 9 telah meningkatkan aktiviti dan 18 menurunkan aktiviti di LA berbanding BN (Rajah 2c).
Aliran kerja untuk membina pengelas nodul pulmonari, termasuk memilih panel terbaik metabolit serum dalam set penemuan menggunakan model regresi logistik binari melalui pengesahan silang sepuluh kali ganda dan menilai prestasi ramalan dalam set pengesahan dalaman dan luaran.b Statistik pengesahan silang model regresi LASSO untuk pemilihan biomarker metabolik.Nombor yang diberikan di atas mewakili purata bilangan biomarker yang dipilih pada λ tertentu.Garis putus-putus merah mewakili nilai purata AUC pada lambda yang sepadan.Bar ralat kelabu mewakili nilai AUC minimum dan maksimum.Garis putus-putus menunjukkan model terbaik dengan 27 biomarker terpilih.AUC, kawasan di bawah lengkung ciri pengendalian penerima (ROC).c Lipat perubahan 27 metabolit terpilih dalam kumpulan LA berbanding dengan kumpulan BN dalam kumpulan penemuan.Lajur merah - pengaktifan.Lajur biru ialah penurunan.d–f Lengkung ciri pengendalian penerima (ROC) menunjukkan kuasa model diskriminasi berdasarkan 27 kombinasi metabolit dalam set pengesahan penemuan, dalaman dan luaran.Data sumber disediakan dalam bentuk fail data sumber.
Model ramalan telah dibuat berdasarkan pekali regresi berwajaran bagi 27 metabolit ini (Jadual Tambahan 3).Analisis ROC berdasarkan 27 metabolit ini menghasilkan kawasan di bawah nilai lengkung (AUC) 0.933, sensitiviti kumpulan penemuan ialah 0.868, dan kekhususan ialah 0.859 (Rajah 2d).Sementara itu, antara 38 metabolit pembezaan beranotasi antara LA dan HC, satu set 16 metabolit mencapai AUC 0.902 dengan kepekaan 0.801 dan kekhususan 0.856 dalam mendiskriminasi LA daripada HC (Tambahan Rajah 6a-c).Nilai AUC berdasarkan ambang perubahan lipatan berbeza untuk metabolit berbeza juga telah dibandingkan.Kami mendapati bahawa model klasifikasi menunjukkan prestasi terbaik dalam mendiskriminasi antara LA dan BN (HC) apabila tahap perubahan lipatan ditetapkan kepada 1.2 berbanding 1.5 atau 2.0 (Tambahan Rajah 7a, b).Model klasifikasi, berdasarkan 27 kumpulan metabolit, telah disahkan selanjutnya dalam kohort dalaman dan luaran.AUC ialah 0.915 (sensitiviti 0.867, kekhususan 0.811) untuk pengesahan dalaman dan 0.945 (kepekaan 0.810, kekhususan 0.979) untuk pengesahan luaran (Rajah 2e, f).Untuk menilai kecekapan antara makmal, 40 sampel daripada kohort luaran dianalisis dalam makmal luaran seperti yang diterangkan dalam bahagian Kaedah.Ketepatan klasifikasi mencapai AUC sebanyak 0.925 (Tambahan Rajah 8).Oleh kerana karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC) adalah subtipe kedua paling biasa bagi kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC) selepas adenokarsinoma paru-paru (LUAD), kami juga menguji kegunaan potensi profil metabolik yang disahkan.BN dan 16 kes LUSC.AUC diskriminasi antara LUSC dan BN ialah 0.776 (Tambahan Rajah 9), menunjukkan keupayaan yang lebih lemah berbanding diskriminasi antara LUAD dan BN.
Kajian telah menunjukkan bahawa saiz nodul pada imej CT berkorelasi positif dengan kemungkinan keganasan dan kekal sebagai penentu utama rawatan nodul25,26,27.Analisis data daripada kohort besar kajian saringan NELSON menunjukkan bahawa risiko keganasan dalam subjek dengan nod <5 mm adalah sama dengan subjek tanpa nod 28 .Oleh itu, saiz minimum yang memerlukan pemantauan CT tetap ialah 5 mm, seperti yang disyorkan oleh British Thoracic Society (BTS), dan 6 mm, seperti yang disyorkan oleh Fleischner Society 29 .Walau bagaimanapun, nodul yang lebih besar daripada 6 mm dan tanpa ciri jinak yang jelas, dipanggil nodul pulmonari tak tentu (IPN), kekal sebagai cabaran utama dalam penilaian dan pengurusan dalam amalan klinikal30,31.Kami seterusnya mengkaji sama ada saiz nodul mempengaruhi tandatangan metabolomik menggunakan sampel terkumpul daripada penemuan dan kohort pengesahan dalaman.Memfokuskan pada 27 biomarker yang disahkan, kami mula-mula membandingkan profil PCA metabolom sub-6 mm HC dan BN.Kami mendapati bahawa kebanyakan titik data untuk HC dan BN bertindih, menunjukkan bahawa tahap metabolit serum adalah serupa dalam kedua-dua kumpulan (Rajah 3a).Peta ciri merentasi julat saiz yang berbeza kekal dipelihara dalam BN dan LA (Rajah 3b, c), manakala pemisahan diperhatikan antara nodul malignan dan benigna dalam julat 6–20 mm (Rajah 3d).Kohort ini mempunyai AUC 0.927, kekhususan 0.868, dan sensitiviti 0.820 untuk meramalkan keganasan nodul berukuran 6 hingga 20 mm (Rajah 3e, f).Keputusan kami menunjukkan bahawa pengelas boleh menangkap perubahan metabolik yang disebabkan oleh transformasi malignan awal, tanpa mengira saiz nodul.
ad Perbandingan profil PCA antara kumpulan tertentu berdasarkan pengelas metabolik 27 metabolit.CC dan BN < 6 mm.b BN < 6 mm lwn BN 6–20 mm.dalam LA 6–20 mm berbanding LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm dan LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Lengkung ciri kendalian penerima (ROC) menunjukkan prestasi model diskriminasi untuk nodul 6–20 mm.f Nilai kebarangkalian dikira berdasarkan model regresi logistik untuk nodul berukuran 6–20 mm.Garis putus-putus kelabu mewakili nilai cutoff optimum (0.455).Angka di atas mewakili peratusan kes yang diunjurkan untuk Los Angeles.Gunakan ujian t Pelajar dua hujung.PCA, analisis komponen utama.Kawasan AUC di bawah lengkung.Data sumber disediakan dalam bentuk fail data sumber.
Empat sampel (berumur 44-61 tahun) dengan saiz nodul pulmonari yang sama (7-9 mm) telah dipilih selanjutnya untuk menggambarkan prestasi model ramalan keganasan yang dicadangkan (Rajah 4a, b).Pada saringan awal, Kes 1 dibentangkan sebagai nodul pepejal dengan kalsifikasi, ciri yang dikaitkan dengan jinak, manakala Kes 2 ditunjukkan sebagai nodul separa pepejal tak tentu tanpa ciri jinak yang jelas.Tiga pusingan imbasan CT susulan menunjukkan bahawa kes-kes ini kekal stabil dalam tempoh 4 tahun dan oleh itu dianggap sebagai nodul benigna (Rajah 4a).Berbanding dengan penilaian klinikal imbasan CT bersiri, analisis metabolit serum satu pukulan dengan model pengelas semasa dengan cepat dan betul mengenal pasti nodul jinak ini berdasarkan kekangan kebarangkalian (Jadual 1).Rajah 4b dalam kes 3 menunjukkan nodul dengan tanda-tanda penarikan balik pleura, yang paling kerap dikaitkan dengan keganasan32.Kes 4 dibentangkan sebagai nodul separa pepejal tak tentu tanpa bukti sebab yang tidak berbahaya.Kesemua kes ini diramalkan sebagai malignan mengikut model pengelas (Jadual 1).Penilaian adenokarsinoma paru-paru ditunjukkan melalui pemeriksaan histopatologi selepas pembedahan reseksi paru-paru (Rajah 4b).Untuk set pengesahan luaran, pengelas metabolik dengan tepat meramalkan dua kes nodul paru-paru tidak tentu yang lebih besar daripada 6 mm (Tambahan Rajah 10).
Imej CT tingkap paksi paru-paru dua kes nodul benigna.Dalam kes 1, imbasan CT selepas 4 tahun menunjukkan nodul pepejal yang stabil berukuran 7 mm dengan kalsifikasi di lobus bawah kanan.Dalam kes 2, imbasan CT selepas 5 tahun mendedahkan nodul yang stabil, separa pepejal dengan diameter 7 mm di lobus atas kanan.b Imej CT tingkap paksi paru-paru dan kajian patologi yang sepadan bagi dua kes adenokarsinoma peringkat I sebelum reseksi paru-paru.Kes 3 mendedahkan nodul dengan diameter 8 mm di lobus atas kanan dengan penarikan balik pleura.Kes 4 mendedahkan nodul kaca tanah separa pepejal berukuran 9 mm di lobus atas kiri.Pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) pada tisu paru-paru yang direseksi (bar skala = 50 μm) menunjukkan corak pertumbuhan acinar adenokarsinoma paru-paru.Anak panah menunjukkan nodul yang dikesan pada imej CT.Imej H&E ialah imej perwakilan berbilang (>3) medan mikroskopik yang diperiksa oleh ahli patologi.
Diambil bersama, keputusan kami menunjukkan potensi nilai biomarker metabolit serum dalam diagnosis pembezaan nodul pulmonari, yang mungkin menimbulkan cabaran apabila menilai pemeriksaan CT.
Berdasarkan panel metabolit pembezaan yang disahkan, kami berusaha untuk mengenal pasti korelasi biologi perubahan metabolik utama.Analisis pengayaan laluan KEGG oleh MetaboAnalyst mengenal pasti 6 laluan biasa yang diubah dengan ketara antara dua kumpulan tertentu (LA vs. HC dan LA vs. BN, diselaraskan p ≤ 0.001, kesan > 0.01).Perubahan ini dicirikan oleh gangguan dalam metabolisme piruvat, metabolisme triptofan, metabolisme niasin dan nikotinamida, glikolisis, kitaran TCA, dan metabolisme purin (Rajah 5a).Kami kemudiannya melakukan metabolomik yang disasarkan untuk mengesahkan perubahan besar menggunakan kuantifikasi mutlak.Penentuan metabolit biasa dalam laluan yang biasa diubah oleh spektrometri jisim kuadrupole tiga kali ganda (QQQ) menggunakan piawaian metabolit tulen.Ciri demografi sampel sasaran kajian metabolomik dimasukkan dalam Jadual Tambahan 4. Selaras dengan keputusan metabolomik global kami, analisis kuantitatif mengesahkan bahawa hipoksantin dan xanthine, piruvat, dan laktat telah meningkat di LA berbanding BN dan HC (Rajah 5b, c, p <0.05).Walau bagaimanapun, tiada perbezaan ketara dalam metabolit ini ditemui antara BN dan HC.
Analisis pengayaan laluan KEGG bagi metabolit yang berbeza secara signifikan dalam kumpulan LA berbanding kumpulan BN dan HC.Globaltest dua ekor telah digunakan, dan nilai p dilaraskan menggunakan kaedah Holm-Bonferroni (dilaraskan p ≤ 0.001 dan saiz kesan > 0.01).b–d Plot biola menunjukkan tahap hipoksantin, xanthine, laktat, piruvat, dan triptofan dalam serum HC, BN, dan LA ditentukan oleh LC-MS/MS (n = 70 setiap kumpulan).Garis putus-putus putih dan hitam masing-masing menunjukkan median dan kuartil.e Plot biola menunjukkan ekspresi mRNA Log2TPM (transkrip per juta) normal SLC7A5 dan QPRT dalam adenokarsinoma paru-paru (n = 513) berbanding tisu paru-paru biasa (n = 59) dalam dataset LUAD-TCGA.Kotak putih mewakili julat antara kuartil, garis hitam mendatar di tengah mewakili median, dan garis hitam menegak yang memanjang dari kotak mewakili selang keyakinan (CI) 95%.f Plot korelasi Pearson bagi ekspresi SLC7A5 dan GAPDH dalam adenokarsinoma paru-paru (n = 513) dan tisu paru-paru normal (n = 59) dalam dataset TCGA.Kawasan kelabu mewakili 95% CI.r, pekali korelasi Pearson.g Tahap tryptophan selular yang dinormalkan dalam sel A549 yang ditransfeksi dengan kawalan shRNA (NC) tidak spesifik dan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) yang ditentukan oleh LC-MS/MS.Analisis statistik lima sampel bebas biologi dalam setiap kumpulan dibentangkan.h Tahap selular NADt (jumlah NAD, termasuk NAD+ dan NADH) dalam sel A549 (NC) dan sel A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2).Analisis statistik tiga sampel bebas biologi dalam setiap kumpulan dibentangkan.i Aktiviti glikolitik sel A549 sebelum dan selepas ketukan SLC7A5 diukur dengan kadar pengasidan ekstraselular (ECAR) (n = 4 sampel bebas biologi setiap kumpulan).2-DG,2-deoksi-D-glukosa.Ujian t Pelajar dua ekor digunakan dalam (b–h).Dalam (g-i), bar ralat mewakili min ± SD, setiap eksperimen dilakukan tiga kali secara bebas dan hasilnya adalah serupa.Data sumber disediakan dalam bentuk fail data sumber.
Memandangkan kesan ketara metabolisme tryptophan yang diubah dalam kumpulan LA, kami juga menilai tahap tryptophan serum dalam kumpulan HC, BN, dan LA menggunakan QQQ.Kami mendapati bahawa tryptophan serum dikurangkan di LA berbanding dengan HC atau BN (p <0.001, Rajah 5d), yang konsisten dengan penemuan sebelumnya bahawa tahap tryptophan yang beredar lebih rendah pada pesakit dengan kanser paru-paru berbanding kawalan sihat dari kumpulan kawalan33,34 ,35.Satu lagi kajian menggunakan pengesan PET/CT 11C-methyl-L-tryptophan mendapati bahawa masa pengekalan isyarat tryptophan dalam tisu kanser paru-paru meningkat dengan ketara berbanding dengan lesi benigna atau tisu normal36.Kami membuat hipotesis bahawa penurunan tryptophan dalam serum LA mungkin mencerminkan pengambilan tryptophan aktif oleh sel-sel kanser paru-paru.
Juga diketahui bahawa produk akhir laluan kynurenine katabolisme tryptophan ialah NAD+37,38, yang merupakan substrat penting untuk tindak balas gliseraldehid-3-fosfat dengan 1,3-bisphosphoglycerate dalam glikolisis39.Walaupun kajian terdahulu telah memberi tumpuan kepada peranan katabolisme tryptophan dalam peraturan imun, kami berusaha untuk menjelaskan interaksi antara disregulasi tryptophan dan laluan glikolitik yang diperhatikan dalam kajian semasa.Pengangkut bahan terlarut keluarga 7 ahli 5 (SLC7A5) dikenali sebagai pengangkut triptofan43,44,45.Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) ialah enzim yang terletak di hilir laluan kynurenine yang menukarkan asid quinolinic kepada NAMN46.Pemeriksaan set data LUAD TCGA mendedahkan bahawa kedua-dua SLC7A5 dan QPRT telah dikawal dengan ketara dalam tisu tumor berbanding dengan tisu biasa (Rajah 5e).Peningkatan ini diperhatikan pada peringkat I dan II serta peringkat III dan IV adenokarsinoma paru-paru (Tambahan Rajah 11), menunjukkan gangguan awal dalam metabolisme tryptophan yang berkaitan dengan tumorigenesis.
Selain itu, dataset LUAD-TCGA menunjukkan korelasi positif antara ekspresi mRNA SLC7A5 dan GAPDH dalam sampel pesakit kanser (r = 0.45, p = 1.55E-26, Rajah 5f).Sebaliknya, tiada korelasi yang ketara ditemui antara tandatangan gen tersebut dalam tisu paru-paru normal (r = 0.25, p = 0.06, Rajah 5f).Penghancuran SLC7A5 (Tambahan Rajah 12) dalam sel A549 dengan ketara mengurangkan tahap tryptophan selular dan NAD (H) (Rajah 5g, h), mengakibatkan aktiviti glikolitik yang dilemahkan seperti yang diukur oleh kadar pengasidan ekstraselular (ECAR) (Rajah 1).5i).Oleh itu, berdasarkan perubahan metabolik dalam pengesanan serum dan in vitro, kami membuat hipotesis bahawa metabolisme tryptophan boleh menghasilkan NAD+ melalui laluan kynurenine dan memainkan peranan penting dalam menggalakkan glikolisis dalam kanser paru-paru.
Kajian telah menunjukkan bahawa sejumlah besar nodul pulmonari tak tentu yang dikesan oleh LDCT mungkin membawa kepada keperluan untuk ujian tambahan seperti PET-CT, biopsi paru-paru, dan rawatan berlebihan disebabkan oleh diagnosis keganasan yang positif palsu.31 Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6, kajian kami mengenal pasti panel metabolit serum dengan nilai diagnostik yang berpotensi yang boleh meningkatkan stratifikasi risiko dan pengurusan seterusnya nodul pulmonari yang dikesan oleh CT.
Nodul pulmonari dinilai menggunakan tomografi pengiraan dos rendah (LDCT) dengan ciri pengimejan yang menunjukkan punca jinak atau malignan.Hasil nodul yang tidak menentu boleh membawa kepada lawatan susulan yang kerap, campur tangan yang tidak perlu, dan rawatan yang berlebihan.Kemasukan pengelas metabolik serum dengan nilai diagnostik boleh meningkatkan penilaian risiko dan pengurusan seterusnya nodul pulmonari.Tomografi pelepasan positron PET.
Data daripada kajian NLST AS dan kajian NELSON Eropah mencadangkan bahawa pemeriksaan kumpulan berisiko tinggi dengan tomografi pengiraan dos rendah (LDCT) boleh mengurangkan kematian kanser paru-paru1,3.Walau bagaimanapun, penilaian risiko dan pengurusan klinikal seterusnya bagi sejumlah besar nodul pulmonari sampingan yang dikesan oleh LDCT kekal sebagai yang paling mencabar.Matlamat utama adalah untuk mengoptimumkan klasifikasi yang betul bagi protokol berasaskan LDCT sedia ada dengan menggabungkan biomarker yang boleh dipercayai.
Biomarker molekul tertentu, seperti metabolit darah, telah dikenal pasti dengan membandingkan kanser paru-paru dengan kawalan yang sihat15,17.Dalam kajian semasa, kami menumpukan pada aplikasi analisis metabolomik serum untuk membezakan antara nodul pulmonari jinak dan malignan yang dikesan secara kebetulan oleh LDCT.Kami membandingkan metabolom serum global kawalan sihat (HC), nodul paru-paru jinak (BN), dan sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) peringkat I menggunakan analisis UPLC-HRMS.Kami mendapati bahawa HC dan BN mempunyai profil metabolik yang sama, manakala LA menunjukkan perubahan yang ketara berbanding HC dan BN.Kami mengenal pasti dua set metabolit serum yang membezakan LA daripada HC dan BN.
Skim pengenalan berasaskan LDCT semasa untuk nodul benigna dan malignan adalah berdasarkan saiz, ketumpatan, morfologi dan kadar pertumbuhan nodul dari semasa ke semasa30.Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa saiz nodul berkait rapat dengan kemungkinan kanser paru-paru.Walaupun pada pesakit berisiko tinggi, risiko keganasan dalam nod <6 mm adalah <1%.Risiko keganasan untuk nodul berukuran 6 hingga 20 mm adalah antara 8% hingga 64%30.Oleh itu, Persatuan Fleischner mengesyorkan diameter potongan 6 mm untuk susulan CT rutin.29 Walau bagaimanapun, penilaian risiko dan pengurusan nodul pulmonari tak tentu (IPN) yang lebih besar daripada 6 mm belum dilakukan dengan secukupnya 31 .Pengurusan semasa penyakit jantung kongenital biasanya berdasarkan menunggu berjaga-jaga dengan pemantauan CT yang kerap.
Berdasarkan metabolom yang disahkan, kami menunjukkan buat pertama kalinya pertindihan tandatangan metabolomik antara individu yang sihat dan nodul jinak <6 mm.Persamaan biologi adalah konsisten dengan penemuan CT sebelumnya bahawa risiko keganasan untuk nodul <6 mm adalah serendah untuk subjek tanpa nod.30 Perlu diingatkan bahawa keputusan kami juga menunjukkan bahawa nodul benigna <6 mm dan ≥6 mm mempunyai tinggi. persamaan dalam profil metabolomik, menunjukkan bahawa definisi fungsi etiologi jinak adalah konsisten tanpa mengira saiz nodul.Oleh itu, panel metabolit serum diagnostik moden boleh menyediakan satu ujian sebagai ujian penghapusan apabila nodul pada mulanya dikesan pada CT dan berpotensi mengurangkan pemantauan bersiri.Pada masa yang sama, panel biomarker metabolik yang sama membezakan nodul malignan bersaiz ≥6 mm daripada nodul benigna dan memberikan ramalan yang tepat untuk IPN saiz yang sama dan ciri morfologi yang samar-samar pada imej CT.Pengelas metabolisme serum ini berfungsi dengan baik dalam meramalkan keganasan nodul ≥6 mm dengan AUC 0.927.Diambil bersama, keputusan kami menunjukkan bahawa tandatangan metabolomik serum yang unik mungkin secara khusus mencerminkan perubahan metabolik yang disebabkan oleh tumor awal dan mempunyai potensi nilai sebagai peramal risiko, bebas daripada saiz nodul.
Terutama, adenokarsinoma paru-paru (LUAD) dan karsinoma sel skuamosa (LUSC) adalah jenis utama kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC).Memandangkan LUSC sangat dikaitkan dengan penggunaan tembakau47 dan LUAD ialah histologi nodul paru-paru sampingan yang paling biasa dikesan pada pemeriksaan CT48, model pengelas kami dibina khusus untuk sampel adenokarsinoma peringkat I.Wang dan rakan sekerja juga memberi tumpuan kepada LUAD dan mengenal pasti sembilan tandatangan lipid menggunakan lipidomik untuk membezakan kanser paru-paru peringkat awal daripada individu yang sihat17.Kami menguji model pengelas semasa pada 16 kes tahap I LUSC dan 74 nodul benigna dan memerhatikan ketepatan ramalan LUSC yang rendah (AUC 0.776), menunjukkan bahawa LUAD dan LUSC mungkin mempunyai tandatangan metabolomik mereka sendiri.Sesungguhnya, LUAD dan LUSC telah terbukti berbeza dalam etiologi, asal biologi dan penyimpangan genetik49.Oleh itu, jenis histologi lain harus dimasukkan dalam model latihan untuk pengesanan kanser paru-paru berasaskan populasi dalam program pemeriksaan.
Di sini, kami mengenal pasti enam laluan yang paling kerap diubah dalam adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan kawalan sihat dan nodul benigna.Xanthine dan hypoxanthine adalah metabolit biasa bagi laluan metabolik purin.Selaras dengan keputusan kami, perantaraan yang dikaitkan dengan metabolisme purin meningkat dengan ketara dalam serum atau tisu pesakit dengan adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan kawalan sihat atau pesakit pada peringkat prainvasif15,50.Tahap xanthine dan hipoksantin serum yang tinggi mungkin mencerminkan anabolisme yang diperlukan oleh sel-sel kanser yang berkembang pesat.Disregulasi metabolisme glukosa adalah ciri khas metabolisme kanser51 yang terkenal.Di sini, kami melihat peningkatan ketara dalam piruvat dan laktat dalam kumpulan LA berbanding dengan kumpulan HC dan BN, yang selaras dengan laporan sebelumnya mengenai keabnormalan laluan glikolitik dalam profil metabolom serum pesakit kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC) dan kawalan yang sihat.keputusan adalah konsisten52,53.
Yang penting, kami melihat korelasi songsang antara metabolisme piruvat dan triptofan dalam serum adenokarsinoma paru-paru.Tahap tryptophan serum dikurangkan dalam kumpulan LA berbanding dengan kumpulan HC atau BN.Menariknya, kajian berskala besar sebelum ini menggunakan kohort prospektif mendapati tahap tryptophan yang beredar yang rendah dikaitkan dengan peningkatan risiko kanser paru-paru 54 .Tryptophan ialah asid amino penting yang kita perolehi sepenuhnya daripada makanan.Kami menyimpulkan bahawa pengurangan serum tryptophan dalam adenokarsinoma paru-paru mungkin mencerminkan pengurangan pesat metabolit ini.Adalah diketahui umum bahawa produk akhir katabolisme tryptophan melalui laluan kynurenine adalah sumber sintesis NAD+ de novo.Oleh kerana NAD+ dihasilkan terutamanya melalui laluan penyelamat, kepentingan NAD+ dalam metabolisme tryptophan dalam kesihatan dan penyakit masih perlu ditentukan46.Analisis kami terhadap pangkalan data TCGA menunjukkan bahawa ekspresi pengangkut zat terlarut triptofan 7A5 (SLC7A5) meningkat dengan ketara dalam adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan kawalan biasa dan berkorelasi positif dengan ekspresi enzim glikolitik GAPDH.Kajian terdahulu memberi tumpuan terutamanya kepada peranan katabolisme tryptophan dalam menekan tindak balas imun antitumor40,41,42.Di sini kami menunjukkan bahawa perencatan pengambilan tryptophan dengan mengetuk SLC7A5 dalam sel-sel kanser paru-paru mengakibatkan penurunan seterusnya dalam tahap NAD selular dan pengurangan aktiviti glikolitik yang serentak.Ringkasnya, kajian kami menyediakan asas biologi untuk perubahan dalam metabolisme serum yang berkaitan dengan transformasi malignan adenokarsinoma paru-paru.
Mutasi EGFR adalah mutasi pemacu yang paling biasa pada pesakit dengan NSCLC.Dalam kajian kami, kami mendapati bahawa pesakit dengan mutasi EGFR (n = 41) mempunyai profil metabolomik keseluruhan yang serupa dengan pesakit dengan EGFR jenis liar (n = 31), walaupun kami mendapati penurunan paras serum beberapa pesakit mutan EGFR dalam pesakit acylcarnitine.Fungsi acylcarnitines yang ditetapkan adalah untuk mengangkut kumpulan asil dari sitoplasma ke dalam matriks mitokondria, yang membawa kepada pengoksidaan asid lemak untuk menghasilkan tenaga 55 .Selaras dengan penemuan kami, kajian baru-baru ini juga mengenal pasti profil metabolom yang serupa antara mutan EGFR dan tumor jenis liar EGFR dengan menganalisis metabolom global 102 sampel tisu adenokarsinoma paru-paru50.Menariknya, kandungan acylcarnitine juga ditemui dalam kumpulan mutan EGFR.Oleh itu, sama ada perubahan dalam tahap acylcarnitine mencerminkan perubahan metabolik yang disebabkan oleh EGFR dan laluan molekul yang mendasari mungkin memerlukan kajian lanjut.
Kesimpulannya, kajian kami mewujudkan pengelas metabolik serum untuk diagnosis pembezaan nodul pulmonari dan mencadangkan aliran kerja yang boleh mengoptimumkan penilaian risiko dan memudahkan pengurusan klinikal berdasarkan pemeriksaan imbasan CT.
Kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Hospital Kanser Universiti Sun Yat-sen, Hospital Gabungan Pertama Universiti Sun Yat-sen, dan Jawatankuasa Etika Hospital Kanser Universiti Zhengzhou.Dalam kumpulan penemuan dan pengesahan dalaman, 174 sera daripada individu yang sihat dan 244 sera daripada nodul benigna telah dikumpulkan daripada individu yang menjalani pemeriksaan perubatan tahunan di Jabatan Kawalan dan Pencegahan Kanser, Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen, dan 166 nodul benigna.serum.Adenokarsinoma paru-paru peringkat I dikumpulkan dari Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen.Dalam kohort pengesahan luaran, terdapat 48 kes nodul benigna, 39 kes adenokarsinoma paru-paru peringkat I dari Hospital Gabungan Pertama Universiti Sun Yat-sen, dan 24 kes adenokarsinoma paru-paru peringkat I dari Hospital Kanser Zhengzhou.Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen juga mengumpul 16 kes kanser paru-paru sel skuamosa peringkat I untuk menguji keupayaan diagnostik pengelas metabolik yang telah ditetapkan (ciri pesakit ditunjukkan dalam Jadual Tambahan 5).Sampel daripada kohort penemuan dan kohort pengesahan dalaman telah dikumpul antara Januari 2018 dan Mei 2020. Sampel untuk kohort pengesahan luaran telah dikumpulkan antara Ogos 2021 dan Oktober 2022. Untuk meminimumkan berat sebelah jantina, kira-kira bilangan kes lelaki dan perempuan yang sama diberikan kepada setiap kohort.Pasukan Penemuan dan Pasukan Kajian Dalaman.Jantina peserta ditentukan berdasarkan laporan diri.Persetujuan termaklum diperoleh daripada semua peserta dan tiada pampasan diberikan.Subjek dengan nodul benigna adalah mereka yang mempunyai skor imbasan CT yang stabil pada 2 hingga 5 tahun pada masa analisis, kecuali untuk 1 kes daripada sampel pengesahan luaran, yang dikumpul sebelum operasi dan didiagnosis oleh histopatologi.Kecuali bronkitis kronik.Kes adenokarsinoma paru-paru dikumpulkan sebelum reseksi paru-paru dan disahkan oleh diagnosis patologi.Sampel darah puasa dikumpulkan dalam tiub pemisahan serum tanpa sebarang antikoagulan.Sampel darah telah dibekukan selama 1 jam pada suhu bilik dan kemudian disentrifugasi pada 2851 × g selama 10 minit pada 4 ° C untuk mengumpul supernatan serum.Aliquot serum dibekukan pada -80°C sehingga pengekstrakan metabolit.Jabatan Pencegahan Kanser dan Pemeriksaan Perubatan Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen mengumpul kumpulan serum daripada 100 penderma yang sihat, termasuk bilangan lelaki dan wanita yang sama berumur 40 hingga 55 tahun.Isipadu yang sama bagi setiap sampel penderma telah dicampur, kolam yang terhasil diasingkan dan disimpan pada -80°C.Campuran serum digunakan sebagai bahan rujukan untuk kawalan kualiti dan penyeragaman data.
Serum rujukan dan sampel ujian telah dicairkan dan metabolit diekstrak menggunakan kaedah pengekstrakan gabungan (MTBE/metanol/air) 56 .Secara ringkas, 50 μl serum dicampur dengan 225 μl metanol sejuk ais dan 750 μl metil tert-butil eter (MTBE) sejuk ais.Kacau campuran dan eramkan pada ais selama 1 jam.Sampel kemudian dicampur dan vorteks dicampur dengan 188 μl air gred MS yang mengandungi piawaian dalaman (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, dan 13C6-isoleucine, yang dibeli dari Cambridge Isotope Laboratories).Campuran kemudiannya disentrifugasi pada 15,000 × g selama 10 minit pada 4 ° C, dan fasa bawah dipindahkan ke dalam dua tiub (125 μL setiap satu) untuk analisis LC-MS dalam mod positif dan negatif.Akhirnya, sampel telah disejat hingga kering dalam penumpu vakum berkelajuan tinggi.
Metabolit kering telah disusun semula dalam 120 μl 80% asetonitril, dipusingkan selama 5 minit, dan disentrifugasi pada 15, 000 × g selama 10 minit pada 4 ° C.Supernatan dipindahkan ke dalam botol kaca ambar dengan mikroinsert untuk kajian metabolomik.Analisis metabolomik tidak disasarkan pada platform spektrometri jisim berprestasi tinggi kromatografi cecair (UPLC-HRMS) cecair berprestasi tinggi.Metabolit diasingkan menggunakan sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC dan lajur ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).Dalam mod ion positif, fasa mudah alih ialah 95% (A) dan 50% asetonitril (B), setiap satu mengandungi 10 mmol/L ammonium asetat dan 0.1% asid formik.Dalam mod negatif, fasa mudah alih A dan B mengandungi masing-masing 95% dan 50% asetonitril, kedua-dua fasa mengandungi 10 mmol/L ammonium asetat, pH = 9. Program kecerunan adalah seperti berikut: 0–0.5 min, 2% B;0.5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1–20 min, 2% B. Lajur dikekalkan pada 40°C dan sampel pada 10°C dalam autosampler.Kadar alir ialah 0.3 ml/min, isipadu suntikan ialah 3 μl.Spektrometer jisim Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) dengan sumber pengionan elektrospray (ESI) telah dikendalikan dalam mod imbasan penuh dan digabungkan dengan mod pemantauan ddMS2 untuk mengumpul volum data yang besar.Parameter MS telah ditetapkan seperti berikut: voltan semburan +3.8 kV/- 3.2 kV, suhu kapilari 320°C, gas pelindung 40 arb, gas tambahan 10 arb, suhu pemanas kuar 350°C, julat pengimbasan 70–1050 m/j, resolusi.70 000. Data diperoleh menggunakan Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Untuk menilai kualiti data, sampel kawalan kualiti (QC) terkumpul telah dihasilkan dengan mengeluarkan 10 μL aliquot supernatan daripada setiap sampel.Enam suntikan sampel kawalan kualiti telah dianalisis pada permulaan jujukan analisis untuk menilai kestabilan sistem UPLC-MS.Sampel kawalan kualiti kemudiannya diperkenalkan secara berkala ke dalam kelompok.Kesemua 11 kelompok sampel serum dalam kajian ini dianalisis oleh LC-MS.Aliquot campuran kolam serum daripada 100 penderma yang sihat telah digunakan sebagai bahan rujukan dalam kelompok masing-masing untuk memantau proses pengekstrakan dan menyesuaikan untuk kesan kelompok ke kelompok.Analisis metabolomik yang tidak disasarkan bagi kohort penemuan, kohort pengesahan dalaman dan kohort pengesahan luaran telah dilakukan di Pusat Metabolomik Universiti Sun Yat-sen.Makmal luar Pusat Analisis dan Pengujian Universiti Teknologi Guangdong turut menganalisis 40 sampel daripada kohort luaran untuk menguji prestasi model pengelas.
Selepas pengekstrakan dan penyusunan semula, kuantiti mutlak metabolit serum diukur menggunakan spektrometri jisim kromatografi cecair berprestasi tinggi (Agilent 6495 triple quadrupole) dengan sumber pengionan elektrospray (ESI) dalam mod pemantauan tindak balas berbilang (MRM).Lajur ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) digunakan untuk memisahkan metabolit.Fasa bergerak terdiri daripada 90% (A) dan 5% asetonitril (B) dengan 10 mmol/L ammonium asetat dan 0.1% larutan ammonia.Program kecerunan adalah seperti berikut: 0–1.5 min, 0% B;1.5–6.5 min, 0–15% B;6.5–8 min, 15% B;8–8.5 min, 15%–0% B;8.5–11.5 min, 0%B.Lajur dikekalkan pada 40 ° C dan sampel pada 10 ° C dalam autosampler.Kadar alir ialah 0.3 mL/min dan isipadu suntikan ialah 1 μL.Parameter MS ditetapkan seperti berikut: voltan kapilari ±3.5 kV, tekanan nebulizer 35 psi, aliran gas sarung 12 L/min, suhu gas sarung 350°C, suhu gas pengeringan 250°C, dan aliran gas pengeringan 14 l/min.Penukaran MRM bagi triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin dan xanthine ialah 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 dan 151.0–107.9 masing-masing.Data dikumpul menggunakan Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Untuk sampel serum, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin, dan xanthine dikira menggunakan lengkung penentukuran larutan campuran standard.Untuk sampel sel, kandungan tryptophan telah dinormalkan kepada standard dalaman dan jisim protein sel.
Pengekstrakan puncak (m/z dan masa pengekalan (RT)) dilakukan menggunakan Compound Discovery 3.1 dan TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Untuk menghapuskan perbezaan potensi antara kelompok, setiap puncak ciri sampel ujian dibahagikan dengan puncak ciri bahan rujukan daripada kelompok yang sama untuk mendapatkan kelimpahan relatif.Sisihan piawai relatif piawai dalaman sebelum dan selepas penyeragaman ditunjukkan dalam Jadual Tambahan 6. Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dicirikan oleh kadar penemuan palsu (FDR<0.05, ujian pangkat ditandatangani Wilcoxon) dan perubahan lipatan (>1.2 atau <0.83).Data MS mentah bagi ciri yang diekstrak dan rujukan data MS yang diperbetulkan serum ditunjukkan dalam Data Tambahan 1 dan Data Tambahan 2, masing-masing.Anotasi puncak dilakukan berdasarkan empat tahap pengenalpastian yang ditentukan, termasuk metabolit yang dikenal pasti, sebatian beranotasi diduga, kelas sebatian yang dicirikan secara diduga, dan sebatian yang tidak diketahui 22 .Berdasarkan carian pangkalan data dalam Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), sebatian biologi dengan piawaian yang disahkan padanan MS/MS atau anotasi padanan tepat dalam mzCloud (skor > 85) atau Chemspider akhirnya dipilih sebagai perantara antara metabolom pembezaan.Anotasi puncak untuk setiap ciri disertakan dalam Data Tambahan 3. MetaboAnalyst 5.0 telah digunakan untuk analisis univariat kelimpahan metabolit ternormal jumlah.MetaboAnalyst 5.0 juga menilai analisis pengayaan laluan KEGG berdasarkan metabolit yang berbeza dengan ketara.Analisis komponen utama (PCA) dan analisis diskriminasi kuasa dua terkecil separa (PLS-DA) telah dianalisis menggunakan pakej perisian ropls (v.1.26.4) dengan penormalan tindanan dan penskalaan auto.Model biomarker metabolit optimum untuk meramalkan keganasan nodul telah dijana menggunakan regresi logistik binari dengan pengecutan mutlak dan operator pemilihan paling sedikit (LASSO, pakej R v.4.1-3).Prestasi model diskriminasi dalam set pengesanan dan pengesahan telah dicirikan dengan menganggarkan AUC berdasarkan analisis ROC mengikut pakej pROC (v.1.18.0.).Potongan kebarangkalian optimum diperoleh berdasarkan indeks Youden maksimum model (sensitiviti + kekhususan - 1).Sampel dengan nilai kurang atau lebih besar daripada ambang akan diramalkan sebagai nodul benigna dan adenokarsinoma paru-paru, masing-masing.
Sel A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) telah ditanam dalam medium F-12K yang mengandungi 10% FBS.Urutan RNA jepit rambut pendek (shRNA) yang menyasarkan SLC7A5 dan kawalan bukan sasaran (NC) telah dimasukkan ke dalam vektor lentiviral pLKO.1-puro.Urutan antisense shSLC7A5 adalah seperti berikut: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Antibodi kepada SLC7A5 (#5347) dan tubulin (#2148) telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel.Antibodi kepada SLC7A5 dan tubulin digunakan pada pencairan 1:1000 untuk analisis Western blot.
Ujian Tekanan Glycolytic XF Kuda Laut mengukur tahap pengasidan ekstraselular (ECAR).Dalam ujian, glukosa, oligomisin A, dan 2-DG ditadbir secara berurutan untuk menguji kapasiti glikolitik selular seperti yang diukur oleh ECAR.
Sel A549 yang ditransfeksi dengan kawalan bukan sasaran (NC) dan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) disalut semalaman dalam piring berdiameter 10 cm.Metabolit sel telah diekstrak dengan 1 ml metanol akueus 80% ais sejuk.Sel-sel dalam larutan metanol dikikis, dikumpulkan ke dalam tiub baru, dan disentrifugasi pada 15,000 × g selama 15 minit pada 4 ° C.Kumpulkan 800 µl supernatan dan keringkan menggunakan penumpu vakum berkelajuan tinggi.Pelet metabolit kering kemudiannya dianalisis untuk tahap tryptophan menggunakan LC-MS/MS seperti yang diterangkan di atas.Tahap NAD(H) selular dalam sel A549 (NC dan shSLC7A5) diukur menggunakan kit kolorimetrik NAD+/NADH kuantitatif (#K337, BioVision) mengikut arahan pengilang.Tahap protein diukur untuk setiap sampel untuk menormalkan jumlah metabolit.
Tiada kaedah statistik digunakan untuk menentukan saiz sampel secara awal.Kajian metabolomik terdahulu yang bertujuan untuk penemuan biomarker15, 18 telah dianggap sebagai penanda aras untuk penentuan saiz, dan berbanding dengan laporan ini, sampel kami adalah mencukupi.Tiada sampel dikecualikan daripada kohort kajian.Sampel serum secara rawak diberikan kepada kumpulan penemuan (306 kes, 74.6%) dan kumpulan pengesahan dalaman (104 kes, 25.4%) untuk kajian metabolomik yang tidak disasarkan.Kami juga secara rawak memilih 70 kes daripada setiap kumpulan daripada set penemuan untuk kajian metabolomik yang disasarkan.Penyiasat telah dibutakan kepada tugasan kumpulan semasa pengumpulan dan analisis data LC-MS.Analisis statistik data metabolomik dan eksperimen sel diterangkan dalam bahagian Keputusan, Legenda Rajah dan Kaedah masing-masing.Kuantifikasi triptofan selular, NADT, dan aktiviti glikolitik dilakukan tiga kali secara bebas dengan hasil yang sama.
Untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang reka bentuk kajian, lihat Abstrak Laporan Portfolio Asli yang dikaitkan dengan artikel ini.
Data MS mentah bagi ciri yang diekstrak dan data MS normal serum rujukan ditunjukkan dalam Data Tambahan 1 dan Data Tambahan 2, masing-masing.Anotasi puncak untuk ciri pembezaan dibentangkan dalam Data Tambahan 3. Set data LUAD TCGA boleh dimuat turun daripada https://portal.gdc.cancer.gov/.Data input untuk memplot graf disediakan dalam data sumber.Data sumber disediakan untuk artikel ini.
Kumpulan Kajian Saringan Paru-paru Kebangsaan, dsb. Mengurangkan kematian kanser paru-paru dengan tomografi pengiraan dos rendah.England Utara.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR dan Nabi, PC Pemeriksaan kanser paru-paru menggunakan CT heliks dos rendah: hasil daripada Kajian Pemeriksaan Paru Kebangsaan (NLST).J. Med.Skrin 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Mengurangkan kematian kanser paru-paru dengan pemeriksaan CT volumetrik dalam percubaan rawak.England Utara.J. Med.382, 503–513 (2020).
Masa siaran: Sep-18-2023