Diagnosis pembezaan nodul pulmonari yang dikenal pasti melalui tomografi berkomputer (CT) masih menjadi cabaran dalam amalan klinikal. Di sini, kami mencirikan metabolit global bagi 480 sampel serum, termasuk kawalan sihat, nodul paru-paru jinak, dan adenokarsinoma paru-paru peringkat I. Adenokarsinoma mempamerkan profil metabolomik yang unik, manakala nodul jinak dan individu yang sihat mempunyai persamaan yang tinggi dalam profil metabolomik. Dalam kumpulan penemuan (n = 306), satu set 27 metabolit telah dikenal pasti untuk membezakan antara nodul jinak dan malignan. AUC model diskriminan dalam kumpulan pengesahan dalaman (n = 104) dan pengesahan luaran (n = 111) masing-masing ialah 0.915 dan 0.945. Analisis laluan mendedahkan peningkatan metabolit glikolitik yang berkaitan dengan penurunan triptofan dalam serum adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan nodul jinak dan kawalan sihat, dan mencadangkan bahawa pengambilan triptofan menggalakkan glikolisis dalam sel kanser paru-paru. Kajian kami mengetengahkan nilai biomarker metabolit serum dalam menilai risiko nodul pulmonari yang dikesan oleh CT.
Diagnosis awal adalah penting untuk meningkatkan kadar survival bagi pesakit kanser. Keputusan daripada Percubaan Saringan Kanser Paru-paru Kebangsaan AS (NLST) dan Kajian NELSON Eropah telah menunjukkan bahawa saringan dengan tomografi berkomputer dos rendah (LDCT) boleh mengurangkan kematian kanser paru-paru dengan ketara dalam kumpulan berisiko tinggi1,2,3. Sejak penggunaan LDCT yang meluas untuk saringan kanser paru-paru, kejadian penemuan radiografi sampingan nodul pulmonari asimptomatik terus meningkat4. Nodul pulmonari ditakrifkan sebagai kelegapan fokal sehingga 3 cm diameter5. Kami menghadapi kesukaran dalam menilai kemungkinan keganasan dan menangani bilangan besar nodul pulmonari yang dikesan secara kebetulan pada LDCT. Batasan CT boleh menyebabkan pemeriksaan susulan yang kerap dan keputusan positif palsu, yang membawa kepada intervensi dan rawatan berlebihan yang tidak perlu6. Oleh itu, terdapat keperluan untuk membangunkan biomarker yang boleh dipercayai dan berguna untuk mengenal pasti kanser paru-paru dengan betul pada peringkat awal dan membezakan kebanyakan nodul jinak pada pengesanan awal7.
Analisis molekul darah yang komprehensif (serum, plasma, sel mononuklear darah periferi), termasuk genomik, proteomik atau metilasi DNA8,9,10, telah membawa kepada minat yang semakin meningkat dalam penemuan biomarker diagnostik untuk kanser paru-paru. Sementara itu, pendekatan metabolomik mengukur produk akhir selular yang dipengaruhi oleh tindakan endogen dan eksogen dan oleh itu digunakan untuk meramalkan permulaan dan hasil penyakit. Spektrometri jisim tandem kromatografi cecair (LC-MS) ialah kaedah yang digunakan secara meluas untuk kajian metabolomik kerana sensitivitinya yang tinggi dan julat dinamik yang besar, yang boleh merangkumi metabolit dengan sifat fizikokimia yang berbeza11,12,13. Walaupun analisis metabolomik global plasma/serum telah digunakan untuk mengenal pasti biomarker yang berkaitan dengan diagnosis kanser paru-paru14,15,16,17 dan keberkesanan rawatan,18 pengelas metabolit serum untuk membezakan antara nodul paru-paru benigna dan malignan masih banyak dikaji. -kajian besar-besaran.
Adenokarsinoma dan karsinoma sel skuamosa adalah dua subjenis utama kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC). Pelbagai ujian saringan CT menunjukkan bahawa adenokarsinoma adalah jenis histologi kanser paru-paru yang paling biasa1,19,20,21. Dalam kajian ini, kami menggunakan kromatografi cecair berprestasi ultra-tinggi-spektrometri jisim resolusi tinggi (UPLC-HRMS) untuk melakukan analisis metabolomik pada sejumlah 695 sampel serum, termasuk kawalan sihat, nodul pulmonari jinak, dan saringan ≤3 cm yang dikesan CT untuk adenokarsinoma paru-paru Tahap I. Kami mengenal pasti panel metabolit serum yang membezakan adenokarsinoma paru-paru daripada nodul jinak dan kawalan sihat. Analisis pengayaan laluan mendedahkan bahawa metabolisme triptofan dan glukosa yang tidak normal adalah perubahan biasa dalam adenokarsinoma paru-paru berbanding nodul jinak dan kawalan sihat. Akhir sekali, kami mewujudkan dan mengesahkan pengelas metabolik serum dengan kekhususan dan kepekaan yang tinggi untuk membezakan antara nodul pulmonari malignan dan jinak yang dikesan oleh LDCT, yang boleh membantu dalam diagnosis pembezaan awal dan penilaian risiko.
Dalam kajian semasa, sampel serum yang dipadankan dengan jantina dan umur telah dikumpulkan secara retrospektif daripada 174 kumpulan kawalan sihat, 292 pesakit dengan nodul pulmonari jinak, dan 229 pesakit dengan adenokarsinoma paru-paru peringkat I. Ciri-ciri demografi 695 subjek ditunjukkan dalam Jadual Tambahan 1.
Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1a, sejumlah 480 sampel serum, termasuk 174 sampel kawalan sihat (HC), 170 nodul jinak (BN), dan 136 sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) peringkat I, telah dikumpulkan di Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen. Kohort penemuan untuk profil metabolomik tidak disasarkan menggunakan spektrometri jisim kromatografi cecair berprestasi ultra-tinggi (UPLC-HRMS). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 1, metabolit pembezaan antara LA dan HC, LA dan BN telah dikenal pasti untuk mewujudkan model klasifikasi dan meneroka analisis laluan pembezaan dengan lebih lanjut. 104 sampel yang dikumpulkan oleh Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen dan 111 sampel yang dikumpulkan oleh dua hospital lain masing-masing telah menjalani pengesahan dalaman dan luaran.
a Populasi kajian dalam kohort penemuan yang menjalani analisis metabolomik serum global menggunakan kromatografi cecair prestasi ultra-spektrometri jisim resolusi tinggi (UPLC-HRMS). b Analisis diskriminan kuasa dua terkecil separa (PLS-DA) bagi jumlah metabolit 480 sampel serum daripada kohort kajian, termasuk kawalan sihat (HC, n = 174), nodul jinak (BN, n = 170), dan adenokarsinoma paru-paru peringkat I (Los Angeles, n = 136). +ESI, mod pengionan elektrosemburan positif, -ESI, mod pengionan elektrosemburan negatif. c–e Metabolit dengan kelimpahan yang berbeza secara signifikan dalam dua kumpulan yang diberikan (ujian pangkat bertanda Wilcoxon dua hujung, nilai p terlaras kadar penemuan palsu, FDR <0.05) ditunjukkan dalam warna merah (perubahan lipatan > 1.2) dan biru (perubahan lipatan < 0.83). ) ditunjukkan pada grafik gunung berapi. Peta haba pengelompokan hierarki menunjukkan perbezaan ketara dalam bilangan metabolit beranotasi antara LA dan BN. Data sumber disediakan dalam bentuk fail data sumber.
Jumlah metabolit serum bagi 174 HC, 170 BN dan 136 LA dalam kumpulan penemuan telah dianalisis menggunakan analisis UPLC-HRMS. Kami mula-mula menunjukkan bahawa sampel kawalan kualiti (QC) berkumpul rapat di tengah model analisis komponen utama (PCA) tanpa pengawasan, mengesahkan kestabilan prestasi kajian semasa (Rajah Tambahan 2).
Seperti yang ditunjukkan dalam analisis diskriminan kuasa dua terkecil separa (PLS-DA) dalam Rajah 1b, kami mendapati terdapat perbezaan yang jelas antara LA dan BN, LA dan HC dalam mod pengionan elektrosemburan positif (+ESI) dan negatif (−ESI). Walau bagaimanapun, tiada perbezaan ketara ditemui antara BN dan HC dalam keadaan +ESI dan -ESI.
Kami menemui 382 ciri pembezaan antara LA dan HC, 231 ciri pembezaan antara LA dan BN, dan 95 ciri pembezaan antara BN dan HC (ujian pangkat bertanda Wilcoxon, FDR <0.05 dan perubahan berganda >1.2 atau <0.83) (Rajah .1c-e). . Puncak telah dianotasi selanjutnya (Data Tambahan 3) terhadap pangkalan data (perpustakaan mzCloud/HMDB/Chemspider) mengikut nilai m/z, masa pengekalan dan carian spektrum jisim pemecahan (butiran diterangkan dalam bahagian Kaedah) 22. Akhir sekali, 33 dan 38 metabolit beranotasi dengan perbezaan ketara dalam kelimpahan telah dikenal pasti untuk LA berbanding BN (Rajah 1f dan Jadual Tambahan 2) dan LA berbanding HC (Rajah Tambahan 3 dan Jadual Tambahan 2) masing-masing. Sebaliknya, hanya 3 metabolit dengan perbezaan ketara dalam kelimpahan telah dikenal pasti dalam BN dan HC (Jadual Tambahan 2), selaras dengan pertindihan antara BN dan HC dalam PLS-DA. Metabolit pembezaan ini merangkumi pelbagai biokimia (Rajah Tambahan 4). Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan perubahan ketara dalam metabolit serum yang mencerminkan transformasi malignan kanser paru-paru peringkat awal berbanding nodul paru-paru jinak atau subjek yang sihat. Sementara itu, persamaan metabolit serum BN dan HC menunjukkan bahawa nodul pulmonari jinak mungkin berkongsi banyak ciri biologi dengan individu yang sihat. Memandangkan mutasi gen reseptor faktor pertumbuhan epidermis (EGFR) adalah perkara biasa dalam subjenis adenokarsinoma paru-paru 23, kami berusaha untuk menentukan kesan mutasi pemacu pada metabolit serum. Kami kemudian menganalisis profil metabolisme keseluruhan 72 kes dengan status EGFR dalam kumpulan adenokarsinoma paru-paru. Menariknya, kami menemui profil yang setanding antara pesakit mutan EGFR (n = 41) dan pesakit jenis liar EGFR (n = 31) dalam analisis PCA (Rajah Tambahan 5a). Walau bagaimanapun, kami mengenal pasti 7 metabolit yang kelimpahannya berubah dengan ketara pada pesakit dengan mutasi EGFR berbanding pesakit dengan EGFR jenis liar (ujian t, p < 0.05 dan perubahan lipatan > 1.2 atau < 0.83) (Rajah Tambahan 5b). Kebanyakan metabolit ini (5 daripada 7) adalah asilkarnitin, yang memainkan peranan penting dalam laluan pengoksidaan asid lemak.
Seperti yang digambarkan dalam aliran kerja yang ditunjukkan dalam Rajah 2a, penanda bio untuk pengelasan nodul diperoleh menggunakan operator pengecutan mutlak terkecil dan pemilihan berdasarkan 33 metabolit pembezaan yang dikenal pasti dalam LA (n = 136) dan BN (n = 170). Gabungan pembolehubah terbaik (LASSO) – model regresi logistik binari. Pengesahan silang sepuluh kali ganda digunakan untuk menguji kebolehpercayaan model. Pemilihan pembolehubah dan regularisasi parameter diselaraskan dengan penalti pemaksimuman kemungkinan dengan parameter λ24. Analisis metabolomik global selanjutnya dilakukan secara bebas dalam kumpulan pengesahan dalaman (n = 104) dan pengesahan luaran (n = 111) untuk menguji prestasi pengelasan model diskriminan. Hasilnya, 27 metabolit dalam set penemuan dikenal pasti sebagai model diskriminan terbaik dengan nilai AUC min terbesar (Rajah 2b), antaranya 9 mempunyai peningkatan aktiviti dan 18 penurunan aktiviti dalam LA berbanding BN (Rajah 2c).
Aliran kerja untuk membina pengelas nodul pulmonari, termasuk memilih panel metabolit serum terbaik dalam set penemuan menggunakan model regresi logistik binari melalui pengesahan silang sepuluh kali ganda dan menilai prestasi ramalan dalam set pengesahan dalaman dan luaran. b Statistik pengesahan silang model regresi LASSO untuk pemilihan biomarker metabolik. Nombor yang diberikan di atas mewakili purata bilangan biomarker yang dipilih pada λ yang diberikan. Garis putus-putus merah mewakili purata nilai AUC pada lambda yang sepadan. Bar ralat kelabu mewakili nilai AUC minimum dan maksimum. Garis putus-putus menunjukkan model terbaik dengan 27 biomarker yang dipilih. AUC, kawasan di bawah lengkung ciri operasi penerima (ROC). c Lipat perubahan 27 metabolit terpilih dalam kumpulan LA berbanding dengan kumpulan BN dalam kumpulan penemuan. Lajur merah – pengaktifan. Lajur biru ialah penurunan. d–f Lengkung ciri operasi penerima (ROC) yang menunjukkan kuasa model diskriminan berdasarkan 27 kombinasi metabolit dalam set pengesahan penemuan, dalaman dan luaran. Data sumber disediakan dalam bentuk fail data sumber.
Satu model ramalan telah dicipta berdasarkan pekali regresi berwajaran bagi 27 metabolit ini (Jadual Tambahan 3). Analisis ROC berdasarkan 27 metabolit ini menghasilkan nilai luas di bawah lengkung (AUC) sebanyak 0.933, sensitiviti kumpulan penemuan ialah 0.868, dan spesifisiti ialah 0.859 (Rajah 2d). Sementara itu, antara 38 metabolit pembezaan beranotasi antara LA dan HC, satu set 16 metabolit mencapai AUC sebanyak 0.902 dengan sensitiviti 0.801 dan spesifisiti 0.856 dalam membezakan LA daripada HC (Rajah Tambahan 6a-c). Nilai AUC berdasarkan ambang perubahan lipatan yang berbeza untuk metabolit pembezaan juga dibandingkan. Kami mendapati bahawa model pengelasan menunjukkan prestasi terbaik dalam membezakan antara LA dan BN (HC) apabila tahap perubahan lipatan ditetapkan kepada 1.2 berbanding 1.5 atau 2.0 (Rajah Tambahan 7a,b). Model pengelasan, berdasarkan 27 kumpulan metabolit, telah disahkan selanjutnya dalam kohort dalaman dan luaran. AUC ialah 0.915 (sensitiviti 0.867, spesifisiti 0.811) untuk pengesahan dalaman dan 0.945 (sensitiviti 0.810, spesifisiti 0.979) untuk pengesahan luaran (Rajah 2e, f). Untuk menilai kecekapan antara makmal, 40 sampel daripada kohort luaran telah dianalisis di makmal luaran seperti yang diterangkan dalam bahagian Kaedah. Ketepatan pengelasan mencapai AUC sebanyak 0.925 (Rajah Tambahan 8). Oleh kerana karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC) merupakan subjenis kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC) kedua paling biasa selepas adenokarsinoma paru-paru (LUAD), kami juga menguji potensi utiliti profil metabolik yang disahkan. BN dan 16 kes LUSC. AUC diskriminasi antara LUSC dan BN ialah 0.776 (Rajah Tambahan 9), menunjukkan keupayaan yang lebih lemah berbanding diskriminasi antara LUAD dan BN.
Kajian telah menunjukkan bahawa saiz nodul pada imej CT berkorelasi positif dengan kemungkinan keganasan dan kekal sebagai penentu utama rawatan nodul25,26,27. Analisis data daripada kohort besar kajian saringan NELSON menunjukkan bahawa risiko keganasan dalam subjek dengan nod <5 mm adalah serupa dengan subjek tanpa nod28. Oleh itu, saiz minimum yang memerlukan pemantauan CT secara berkala ialah 5 mm, seperti yang disyorkan oleh British Thoracic Society (BTS), dan 6 mm, seperti yang disyorkan oleh Fleischner Society29. Walau bagaimanapun, nodul yang lebih besar daripada 6 mm dan tanpa ciri-ciri jinak yang jelas, yang dipanggil nodul pulmonari tak tentu (IPN), kekal sebagai cabaran utama dalam penilaian dan pengurusan dalam amalan klinikal30,31. Kami seterusnya mengkaji sama ada saiz nodul mempengaruhi tandatangan metabolomik menggunakan sampel terkumpul daripada kohort penemuan dan pengesahan dalaman. Dengan memberi tumpuan kepada 27 biomarker yang disahkan, kami mula-mula membandingkan profil PCA metabolit HC dan BN sub-6 mm. Kami mendapati bahawa kebanyakan titik data untuk HC dan BN bertindih, menunjukkan bahawa tahap metabolit serum adalah serupa dalam kedua-dua kumpulan (Rajah 3a). Peta ciri merentasi julat saiz yang berbeza kekal terpelihara dalam BN dan LA (Rajah 3b, c), manakala pemisahan diperhatikan antara nodul malignan dan jinak dalam julat 6–20 mm (Rajah 3d). Kohort ini mempunyai AUC 0.927, kekhususan 0.868, dan kepekaan 0.820 untuk meramalkan keganasan nodul berukuran 6 hingga 20 mm (Rajah 3e, f). Keputusan kami menunjukkan bahawa pengelas boleh menangkap perubahan metabolik yang disebabkan oleh transformasi malignan awal, tanpa mengira saiz nodul.
Perbandingan profil PCA antara kumpulan tertentu berdasarkan pengelas metabolik 27 metabolit. CC dan BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. dalam LA 6–20 mm berbanding LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm dan LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Lengkung ciri operasi penerima (ROC) yang menunjukkan prestasi model diskriminan untuk nodul 6–20 mm. f Nilai kebarangkalian dikira berdasarkan model regresi logistik untuk nodul berukuran 6–20 mm. Garis putus-putus kelabu mewakili nilai pemotongan optimum (0.455). Nombor di atas mewakili peratusan kes yang diunjurkan untuk Los Angeles. Gunakan ujian t Pelajar dua hujung. PCA, analisis komponen utama. Kawasan AUC di bawah lengkung. Data sumber disediakan dalam bentuk fail data sumber.
Empat sampel (berumur 44–61 tahun) dengan saiz nodul pulmonari yang serupa (7–9 mm) telah dipilih selanjutnya untuk menggambarkan prestasi model ramalan keganasan yang dicadangkan (Rajah 4a, b). Pada saringan awal, Kes 1 muncul sebagai nodul pepejal dengan pengapuran, satu ciri yang berkaitan dengan benigna, manakala Kes 2 muncul sebagai nodul separa pepejal tak tentu tanpa ciri benigna yang jelas. Tiga pusingan imbasan CT susulan menunjukkan bahawa kes-kes ini kekal stabil dalam tempoh 4 tahun dan oleh itu dianggap sebagai nodul benigna (Rajah 4a). Berbanding dengan penilaian klinikal imbasan CT bersiri, analisis metabolit serum suntikan tunggal dengan model pengelas semasa mengenal pasti nodul benigna ini dengan cepat dan betul berdasarkan kekangan kebarangkalian (Jadual 1). Rajah 4b dalam kes 3 menunjukkan nodul dengan tanda-tanda retraksi pleura, yang paling sering dikaitkan dengan keganasan32. Kes 4 muncul sebagai nodul separa pepejal tak tentu tanpa bukti punca benigna. Semua kes ini diramalkan sebagai malignan mengikut model pengelas (Jadual 1). Penilaian adenokarsinoma paru-paru ditunjukkan melalui pemeriksaan histopatologi selepas pembedahan reseksi paru-paru (Rajah 4b). Bagi set pengesahan luaran, pengelas metabolik meramalkan dua kes nodul paru-paru tak tentu yang lebih besar daripada 6 mm dengan tepat (Rajah Tambahan 10).
Imej CT tetingkap aksial paru-paru bagi dua kes nodul jinak. Dalam kes 1, imbasan CT selepas 4 tahun menunjukkan nodul pepejal yang stabil berukuran 7 mm dengan pengapuran di lobus kanan bawah. Dalam kes 2, imbasan CT selepas 5 tahun mendedahkan nodul separa pepejal yang stabil dengan diameter 7 mm di lobus kanan atas. b Imej CT tetingkap aksial paru-paru dan kajian patologi yang sepadan bagi dua kes adenokarsinoma peringkat I sebelum reseksi paru-paru. Kes 3 mendedahkan nodul dengan diameter 8 mm di lobus kanan atas dengan retraksi pleura. Kes 4 mendedahkan nodul kaca tanah separa pepejal berukuran 9 mm di lobus kiri atas. Pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E) tisu paru-paru yang direseksi (bar skala = 50 μm) menunjukkan corak pertumbuhan asinar adenokarsinoma paru-paru. Anak panah menunjukkan nodul yang dikesan pada imej CT. Imej H&E ialah imej perwakilan pelbagai (>3) medan mikroskopik yang diperiksa oleh ahli patologi.
Secara keseluruhannya, keputusan kami menunjukkan nilai potensi biomarker metabolit serum dalam diagnosis pembezaan nodul pulmonari, yang mungkin menimbulkan cabaran semasa menilai saringan CT.
Berdasarkan panel metabolit pembezaan yang disahkan, kami berusaha untuk mengenal pasti korelasi biologi bagi perubahan metabolik utama. Analisis pengayaan laluan KEGG oleh MetaboAnalyst mengenal pasti 6 laluan biasa yang diubah dengan ketara antara dua kumpulan yang diberikan (LA vs. HC dan LA vs. BN, p ≤ 0.001 yang diselaraskan, kesan > 0.01). Perubahan ini dicirikan oleh gangguan dalam metabolisme piruvat, metabolisme triptofan, metabolisme niasin dan nikotinamida, glikolisis, kitaran TCA dan metabolisme purin (Rajah 5a). Kami kemudian menjalankan metabolomik yang disasarkan untuk mengesahkan perubahan utama menggunakan kuantifikasi mutlak. Penentuan metabolit biasa dalam laluan biasa yang diubah dengan spektrometri jisim kuadrupol tiga (QQQ) menggunakan piawaian metabolit yang sahih. Ciri-ciri demografi sampel sasaran kajian metabolomik disertakan dalam Jadual Tambahan 4. Selaras dengan keputusan metabolomik global kami, analisis kuantitatif mengesahkan bahawa hipoksantin dan xantin, piruvat dan laktat meningkat dalam LA berbanding BN dan HC (Rajah 5b, c, p <0.05). Walau bagaimanapun, tiada perbezaan ketara dalam metabolit ini ditemui antara BN dan HC.
Analisis pengayaan laluan KEGG bagi metabolit yang berbeza secara signifikan dalam kumpulan LA berbanding kumpulan BN dan HC. Globaltest dua hujung telah digunakan, dan nilai p telah diselaraskan menggunakan kaedah Holm-Bonferroni (p diselaraskan ≤ 0.001 dan saiz kesan > 0.01). b–d Plot Biola menunjukkan tahap hipoksantin, xantin, laktat, piruvat dan triptofan dalam serum HC, BN dan LA yang ditentukan oleh LC-MS/MS (n = 70 setiap kumpulan). Garis putus-putus putih dan hitam menunjukkan median dan kuartil masing-masing. e Plot Biola menunjukkan ekspresi mRNA Log2TPM (transkrip per juta) SLC7A5 dan QPRT yang dinormalisasi dalam adenokarsinoma paru-paru (n = 513) berbanding tisu paru-paru normal (n = 59) dalam set data LUAD-TCGA. Kotak putih mewakili julat antara kuartil, garis hitam mendatar di tengah mewakili median, dan garis hitam menegak yang memanjang dari kotak mewakili selang keyakinan 95% (CI). f Plot korelasi Pearson bagi ekspresi SLC7A5 dan GAPDH dalam adenokarsinoma paru-paru (n = 513) dan tisu paru-paru normal (n = 59) dalam set data TCGA. Kawasan kelabu mewakili 95% CI. r, pekali korelasi Pearson. g Tahap triptofan selular yang dinormalisasi dalam sel A549 yang ditransfeksi dengan kawalan shRNA tak spesifik (NC) dan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) yang ditentukan oleh LC-MS/MS. Analisis statistik lima sampel bebas secara biologi dalam setiap kumpulan dibentangkan. h Tahap selular NADt (jumlah NAD, termasuk NAD+ dan NADH) dalam sel A549 (NC) dan sel A549 knockdown SLC7A5 (Sh1, Sh2). Analisis statistik tiga sampel bebas secara biologi dalam setiap kumpulan dibentangkan. Aktiviti glikolitik sel A549 sebelum dan selepas penurunan SLC7A5 diukur dengan kadar pengasidan ekstraselular (ECAR) (n = 4 sampel bebas secara biologi setiap kumpulan). 2-DG,2-deoksi-D-glukosa. Ujian t Pelajar Dua Hujung telah digunakan dalam (b–h). Dalam (g–i), bar ralat mewakili min ± SD, setiap eksperimen dijalankan tiga kali secara bebas dan hasilnya adalah serupa. Data sumber disediakan dalam bentuk fail data sumber.
Memandangkan kesan ketara perubahan metabolisme triptofan dalam kumpulan LA, kami juga menilai tahap triptofan serum dalam kumpulan HC, BN dan LA menggunakan QQQ. Kami mendapati bahawa triptofan serum berkurangan dalam LA berbanding dengan HC atau BN (p < 0.001, Rajah 5d), yang konsisten dengan penemuan terdahulu bahawa tahap triptofan yang beredar adalah lebih rendah pada pesakit kanser paru-paru berbanding kawalan sihat daripada kumpulan kawalan33,34,35. Satu lagi kajian menggunakan pengesan PET/CT 11C-metil-L-triptofan mendapati bahawa masa pengekalan isyarat triptofan dalam tisu kanser paru-paru meningkat dengan ketara berbanding lesi jinak atau tisu normal36. Kami membuat hipotesis bahawa penurunan triptofan dalam serum LA mungkin mencerminkan pengambilan triptofan aktif oleh sel kanser paru-paru.
Telah diketahui juga bahawa hasil akhir laluan kynurenina bagi katabolisme triptofan ialah NAD+37,38, yang merupakan substrat penting untuk tindak balas gliseraldehid-3-fosfat dengan 1,3-bifosfogliserat dalam glikolisis39. Walaupun kajian terdahulu telah menumpukan pada peranan katabolisme triptofan dalam pengawalaturan imun, kami cuba menjelaskan interaksi antara disregulasi triptofan dan laluan glikolitik yang diperhatikan dalam kajian semasa. Keluarga pengangkut zat terlarut 7 ahli 5 (SLC7A5) dikenali sebagai pengangkut triptofan43,44,45. Fosforibosiltransferase asid kuinolinik (QPRT) ialah enzim yang terletak di hilir laluan kynurenina yang menukarkan asid kuinolinik kepada NAMN46. Pemeriksaan set data LUAD TCGA mendedahkan bahawa kedua-dua SLC7A5 dan QPRT telah meningkat dengan ketara dalam tisu tumor berbanding tisu normal (Rajah 5e). Peningkatan ini diperhatikan pada peringkat I dan II serta peringkat III dan IV adenokarsinoma paru-paru (Rajah Tambahan 11), menunjukkan gangguan awal dalam metabolisme triptofan yang berkaitan dengan tumorigenesis.
Selain itu, set data LUAD-TCGA menunjukkan korelasi positif antara ekspresi mRNA SLC7A5 dan GAPDH dalam sampel pesakit kanser (r = 0.45, p = 1.55E-26, Rajah 5f). Sebaliknya, tiada korelasi yang ketara ditemui antara tandatangan gen tersebut dalam tisu paru-paru normal (r = 0.25, p = 0.06, Rajah 5f). Pengecutan SLC7A5 (Rajah Tambahan 12) dalam sel A549 mengurangkan tahap triptofan selular dan NAD(H) dengan ketara (Rajah 5g,h), mengakibatkan aktiviti glikolitik yang dilemahkan seperti yang diukur oleh kadar pengasidan ekstraselular (ECAR) (Rajah 1). 5i). Oleh itu, berdasarkan perubahan metabolik dalam serum dan pengesanan in vitro, kami membuat hipotesis bahawa metabolisme triptofan boleh menghasilkan NAD+ melalui laluan kynurenine dan memainkan peranan penting dalam menggalakkan glikolisis dalam kanser paru-paru.
Kajian telah menunjukkan bahawa sebilangan besar nodul pulmonari tak tentu yang dikesan oleh LDCT boleh menyebabkan keperluan untuk ujian tambahan seperti PET-CT, biopsi paru-paru dan rawatan berlebihan disebabkan oleh diagnosis keganasan positif palsu.31 Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6, kajian kami mengenal pasti panel metabolit serum dengan nilai diagnostik yang berpotensi yang boleh meningkatkan stratifikasi risiko dan pengurusan nodul pulmonari seterusnya yang dikesan oleh CT.
Nodul pulmonari dinilai menggunakan tomografi berkomputer dos rendah (LDCT) dengan ciri pengimejan yang menunjukkan punca jinak atau malignan. Hasil nodul yang tidak menentu boleh menyebabkan lawatan susulan yang kerap, intervensi yang tidak perlu dan rawatan berlebihan. Kemasukan pengelas metabolik serum dengan nilai diagnostik boleh meningkatkan penilaian risiko dan pengurusan nodul pulmonari seterusnya. Tomografi pancaran positron PET.
Data daripada kajian NLST AS dan kajian NELSON Eropah menunjukkan bahawa penyaringan kumpulan berisiko tinggi dengan tomografi berkomputer dos rendah (LDCT) boleh mengurangkan kematian akibat kanser paru-paru1,3. Walau bagaimanapun, penilaian risiko dan pengurusan klinikal seterusnya bagi sejumlah besar nodul pulmonari sampingan yang dikesan oleh LDCT kekal sebagai yang paling mencabar. Matlamat utama adalah untuk mengoptimumkan klasifikasi protokol berasaskan LDCT sedia ada yang betul dengan menggabungkan penanda biologi yang boleh dipercayai.
Biomarker molekul tertentu, seperti metabolit darah, telah dikenal pasti dengan membandingkan kanser paru-paru dengan kawalan sihat15,17. Dalam kajian semasa, kami menumpukan pada aplikasi analisis metabolomik serum untuk membezakan antara nodul pulmonari jinak dan malignan yang dikesan secara tidak sengaja oleh LDCT. Kami membandingkan metabolit serum global kawalan sihat (HC), nodul paru-paru jinak (BN), dan sampel adenokarsinoma paru-paru (LA) peringkat I menggunakan analisis UPLC-HRMS. Kami mendapati bahawa HC dan BN mempunyai profil metabolik yang serupa, manakala LA menunjukkan perubahan yang ketara berbanding HC dan BN. Kami mengenal pasti dua set metabolit serum yang membezakan LA daripada HC dan BN.
Skim pengenalpastian berasaskan LDCT semasa untuk nodul jinak dan malignan adalah berdasarkan saiz, ketumpatan, morfologi dan kadar pertumbuhan nodul dari semasa ke semasa30. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa saiz nodul berkait rapat dengan kemungkinan kanser paru-paru. Walaupun pada pesakit berisiko tinggi, risiko keganasan dalam nod <6 mm adalah <1%. Risiko keganasan untuk nodul berukuran 6 hingga 20 mm adalah antara 8% hingga 64%.30 Oleh itu, Fleischner Society mengesyorkan diameter pemotongan 6 mm untuk susulan CT rutin.29 Walau bagaimanapun, penilaian risiko dan pengurusan nodul pulmonari tak tentu (IPN) yang lebih besar daripada 6 mm belum dilakukan dengan secukupnya31. Pengurusan penyakit jantung kongenital semasa biasanya berdasarkan menunggu dengan teliti dengan pemantauan CT yang kerap.
Berdasarkan metabolit yang disahkan, kami menunjukkan buat kali pertama pertindihan tandatangan metabolomik antara individu yang sihat dan nodul jinak <6 mm. Persamaan biologi adalah konsisten dengan penemuan CT sebelumnya bahawa risiko keganasan untuk nodul <6 mm adalah serendah subjek tanpa nod.30 Perlu diingatkan bahawa keputusan kami juga menunjukkan bahawa nodul jinak <6 mm dan ≥6 mm mempunyai persamaan yang tinggi dalam profil metabolomik, menunjukkan bahawa definisi fungsi etiologi jinak adalah konsisten tanpa mengira saiz nodul. Oleh itu, panel metabolit serum diagnostik moden boleh menyediakan ujian tunggal sebagai ujian pengecualian apabila nodul pada mulanya dikesan pada CT dan berpotensi mengurangkan pemantauan bersiri. Pada masa yang sama, panel biomarker metabolik yang sama membezakan nodul malignan bersaiz ≥6 mm daripada nodul jinak dan memberikan ramalan yang tepat untuk IPN yang mempunyai saiz yang sama dan ciri morfologi yang samar-samar pada imej CT. Pengelas metabolisme serum ini menunjukkan prestasi yang baik dalam meramalkan keganasan nodul ≥6 mm dengan AUC 0.927. Secara keseluruhannya, keputusan kami menunjukkan bahawa tandatangan metabolisme serum yang unik mungkin secara khusus mencerminkan perubahan metabolik awal yang disebabkan oleh tumor dan mempunyai nilai berpotensi sebagai peramal risiko, tanpa mengira saiz nodul.
Terutamanya, adenokarsinoma paru-paru (LUAD) dan karsinoma sel skuamosa (LUSC) adalah jenis utama kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC). Memandangkan LUSC sangat berkaitan dengan penggunaan tembakau47 dan LUAD adalah histologi nodul paru-paru sampingan yang paling biasa dikesan pada saringan CT48, model pengelas kami dibina khusus untuk sampel adenokarsinoma peringkat I. Wang dan rakan sekerja juga menumpukan pada LUAD dan mengenal pasti sembilan tanda lipid menggunakan lipidomik untuk membezakan kanser paru-paru peringkat awal daripada individu yang sihat17. Kami menguji model pengelas semasa pada 16 kes LUSC peringkat I dan 74 nodul jinak dan memerhatikan ketepatan ramalan LUSC yang rendah (AUC 0.776), menunjukkan bahawa LUAD dan LUSC mungkin mempunyai tanda metabolomik mereka sendiri. Malah, LUAD dan LUSC telah terbukti berbeza dalam etiologi, asal usul biologi dan penyimpangan genetik49. Oleh itu, jenis histologi lain harus dimasukkan dalam model latihan untuk pengesanan kanser paru-paru berasaskan populasi dalam program saringan.
Di sini, kami mengenal pasti enam laluan yang paling kerap diubah dalam adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan kawalan sihat dan nodul jinak. Xantina dan hipoksantina adalah metabolit biasa bagi laluan metabolik purin. Selaras dengan keputusan kami, perantaraan yang berkaitan dengan metabolisme purin meningkat dengan ketara dalam serum atau tisu pesakit dengan adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan kawalan sihat atau pesakit pada peringkat prainvasif15,50. Tahap xantina dan hipoksantina serum yang tinggi mungkin mencerminkan anabolisme yang diperlukan oleh sel-sel kanser yang membiak dengan cepat. Disregulasi metabolisme glukosa adalah ciri metabolisme kanser yang terkenal51. Di sini, kami memerhatikan peningkatan ketara dalam piruvat dan laktat dalam kumpulan LA berbanding dengan kumpulan HC dan BN, yang selaras dengan laporan terdahulu tentang keabnormalan laluan glikolitik dalam profil metabolit serum pesakit kanser paru-paru bukan sel kecil (NSCLC) dan kawalan sihat. hasilnya konsisten52,53.
Yang penting, kami memerhatikan korelasi songsang antara metabolisme piruvat dan triptofan dalam serum adenokarsinoma paru-paru. Tahap triptofan serum berkurangan dalam kumpulan LA berbanding kumpulan HC atau BN. Menariknya, kajian berskala besar sebelum ini menggunakan kohort prospektif mendapati bahawa tahap triptofan yang beredar rendah dikaitkan dengan peningkatan risiko kanser paru-paru 54. Triptofan ialah asid amino penting yang kita peroleh sepenuhnya daripada makanan. Kami menyimpulkan bahawa penipisan triptofan serum dalam adenokarsinoma paru-paru mungkin mencerminkan penipisan metabolit ini yang cepat. Telah diketahui umum bahawa produk akhir katabolisme triptofan melalui laluan kynurenine adalah sumber sintesis NAD+ de novo. Oleh kerana NAD+ dihasilkan terutamanya melalui laluan salvage, kepentingan NAD+ dalam metabolisme triptofan dalam kesihatan dan penyakit masih belum ditentukan 46. Analisis kami terhadap pangkalan data TCGA menunjukkan bahawa ekspresi pengangkut triptofan, pengangkut zat terlarut 7A5 (SLC7A5) meningkat dengan ketara dalam adenokarsinoma paru-paru berbanding dengan kawalan normal dan berkorelasi positif dengan ekspresi enzim glikolitik GAPDH. Kajian terdahulu tertumpu terutamanya pada peranan katabolisme triptofan dalam menyekat tindak balas imun antitumor40,41,42. Di sini kami menunjukkan bahawa perencatan pengambilan triptofan melalui penurunan SLC7A5 dalam sel kanser paru-paru mengakibatkan penurunan seterusnya dalam tahap NAD selular dan pelemahan aktiviti glikolitik secara serentak. Secara ringkasnya, kajian kami menyediakan asas biologi untuk perubahan dalam metabolisme serum yang berkaitan dengan transformasi malignan adenokarsinoma paru-paru.
Mutasi EGFR adalah mutasi pemacu yang paling biasa pada pesakit NSCLC. Dalam kajian kami, kami mendapati bahawa pesakit dengan mutasi EGFR (n = 41) mempunyai profil metabolisme keseluruhan yang serupa dengan pesakit dengan EGFR jenis liar (n = 31), walaupun kami mendapati tahap serum beberapa pesakit mutan EGFR yang menurun dalam pesakit asilkarnitin. Fungsi asilkarnitin yang telah ditetapkan adalah untuk mengangkut kumpulan asil dari sitoplasma ke dalam matriks mitokondria, yang membawa kepada pengoksidaan asid lemak untuk menghasilkan tenaga 55. Selaras dengan penemuan kami, satu kajian baru-baru ini juga mengenal pasti profil metabolit yang serupa antara tumor mutan EGFR dan jenis liar EGFR dengan menganalisis metabolit global 102 sampel tisu adenokarsinoma paru-paru 50. Menariknya, kandungan asilkarnitin juga ditemui dalam kumpulan mutan EGFR. Oleh itu, sama ada perubahan dalam tahap asilkarnitin mencerminkan perubahan metabolik yang disebabkan oleh EGFR dan laluan molekul yang mendasarinya mungkin memerlukan kajian lanjut.
Kesimpulannya, kajian kami mewujudkan pengelas metabolik serum untuk diagnosis pembezaan nodul pulmonari dan mencadangkan aliran kerja yang boleh mengoptimumkan penilaian risiko dan memudahkan pengurusan klinikal berdasarkan saringan imbasan CT.
Kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Hospital Kanser Universiti Sun Yat-sen, Hospital Gabungan Pertama Universiti Sun Yat-sen, dan Jawatankuasa Etika Hospital Kanser Universiti Zhengzhou. Dalam kumpulan penemuan dan pengesahan dalaman, 174 sera daripada individu yang sihat dan 244 sera daripada nodul jinak telah dikumpulkan daripada individu yang menjalani pemeriksaan perubatan tahunan di Jabatan Kawalan dan Pencegahan Kanser, Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen, dan 166 nodul jinak. serum. Adenokarsinoma paru-paru peringkat I telah dikumpulkan dari Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen. Dalam kohort pengesahan luaran, terdapat 48 kes nodul jinak, 39 kes adenokarsinoma paru-paru peringkat I dari Hospital Gabungan Pertama Universiti Sun Yat-sen, dan 24 kes adenokarsinoma paru-paru peringkat I dari Hospital Kanser Zhengzhou. Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen juga mengumpul 16 kes kanser paru-paru sel skuamosa peringkat I untuk menguji keupayaan diagnostik pengelas metabolik yang telah ditetapkan (ciri-ciri pesakit ditunjukkan dalam Jadual Tambahan 5). Sampel daripada kohort penemuan dan kohort pengesahan dalaman telah dikumpulkan antara Januari 2018 dan Mei 2020. Sampel untuk kohort pengesahan luaran telah dikumpulkan antara Ogos 2021 dan Oktober 2022. Untuk meminimumkan bias jantina, bilangan kes lelaki dan wanita yang hampir sama telah diberikan kepada setiap kohort. Pasukan Penemuan dan Pasukan Semakan Dalaman. Jantina peserta ditentukan berdasarkan laporan kendiri. Persetujuan termaklum telah diperoleh daripada semua peserta dan tiada pampasan diberikan. Subjek dengan nodul jinak adalah mereka yang mempunyai skor imbasan CT yang stabil pada 2 hingga 5 tahun pada masa analisis, kecuali 1 kes daripada sampel pengesahan luaran, yang dikumpulkan sebelum pembedahan dan didiagnosis melalui histopatologi. Kecuali bronkitis kronik. Kes adenokarsinoma paru-paru dikumpulkan sebelum reseksi paru-paru dan disahkan melalui diagnosis patologi. Sampel darah puasa dikumpulkan dalam tiub pemisahan serum tanpa sebarang antikoagulan. Sampel darah digumpalkan selama 1 jam pada suhu bilik dan kemudian disentrifugasi pada 2851 × g selama 10 minit pada suhu 4°C untuk mengumpul supernatan serum. Alikuot serum dibekukan pada suhu -80°C sehingga pengekstrakan metabolit. Jabatan Pencegahan Kanser dan Pemeriksaan Perubatan Pusat Kanser Universiti Sun Yat-sen telah mengumpul sekumpulan serum daripada 100 penderma yang sihat, termasuk bilangan lelaki dan wanita yang sama berumur 40 hingga 55 tahun. Isipadu yang sama bagi setiap sampel penderma telah dicampurkan, kumpulan yang terhasil telah diagihkan dan disimpan pada suhu -80°C. Campuran serum telah digunakan sebagai bahan rujukan untuk kawalan kualiti dan penyeragaman data.
Serum rujukan dan sampel ujian telah dicairkan dan metabolit telah diekstrak menggunakan kaedah pengekstrakan gabungan (MTBE/metanol/air) 56. Secara ringkas, 50 μl serum telah dicampurkan dengan 225 μl metanol sejuk dan 750 μl metil tert-butil eter (MTBE) sejuk. Kacau campuran dan inkubasi di atas ais selama 1 jam. Sampel kemudiannya dicampurkan dan divorteks dicampurkan dengan 188 μl air gred MS yang mengandungi piawai dalaman (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionina dan 13C6-isoleusina, yang dibeli daripada Cambridge Isotope Laboratories). Campuran kemudiannya disentrifugasi pada 15,000 × g selama 10 minit pada suhu 4 °C, dan fasa bawah dipindahkan ke dalam dua tiub (125 μL setiap satu) untuk analisis LC-MS dalam mod positif dan negatif. Akhir sekali, sampel telah disejat sehingga kering dalam penumpu vakum berkelajuan tinggi.
Metabolit kering telah dibentuk semula dalam 120 μl 80% asetonitril, divorteks selama 5 minit, dan disentrifugasi pada 15,000 × g selama 10 minit pada suhu 4°C. Supernatan dipindahkan ke dalam vial kaca ambar dengan mikroinsert untuk kajian metabolomik. Analisis metabolomik tanpa sasaran pada platform kromatografi cecair berprestasi ultra-tinggi-spektrometri jisim resolusi tinggi (UPLC-HRMS). Metabolit diasingkan menggunakan sistem Dionex Ultimate 3000 UPLC dan lajur ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). Dalam mod ion positif, fasa bergerak ialah 95% (A) dan 50% asetonitril (B), setiap satunya mengandungi 10 mmol/L ammonium asetat dan 0.1% asid formik. Dalam mod negatif, fasa bergerak A dan B masing-masing mengandungi 95% dan 50% asetonitril, kedua-dua fasa mengandungi 10 mmol/L ammonium asetat, pH = 9. Program kecerunan adalah seperti berikut: 0–0.5 min, 2% B; 0.5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16.1 min, 98–2% B; 16.1–20 min, 2% B. Lajur dikekalkan pada suhu 40°C dan sampel pada suhu 10°C dalam autosampler. Kadar aliran ialah 0.3 ml/min, isipadu suntikan ialah 3 μl. Spektrometer jisim Orbitrap Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) dengan sumber pengionan elektrosemburan (ESI) telah dikendalikan dalam mod imbasan penuh dan digandingkan dengan mod pemantauan ddMS2 untuk mengumpul sejumlah besar data. Parameter MS ditetapkan seperti berikut: voltan semburan +3.8 kV/- 3.2 kV, suhu kapilari 320°C, gas pelindung 40 arb, gas bantu 10 arb, suhu pemanas prob 350°C, julat imbasan 70–1050 m/j, resolusi 70 000. Data diperoleh menggunakan Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Untuk menilai kualiti data, sampel kawalan kualiti terkumpul (QC) dijana dengan mengeluarkan 10 μL alikuot supernatan daripada setiap sampel. Enam suntikan sampel kawalan kualiti dianalisis pada permulaan jujukan analitikal untuk menilai kestabilan sistem UPLC-MS. Sampel kawalan kualiti kemudiannya dimasukkan secara berkala ke dalam kelompok. Kesemua 11 kelompok sampel serum dalam kajian ini dianalisis dengan LC-MS. Alikuot campuran kumpulan serum daripada 100 penderma sihat digunakan sebagai bahan rujukan dalam kelompok masing-masing untuk memantau proses pengekstrakan dan melaraskan kesan kelompok demi kelompok. Analisis metabolomik tidak disasarkan bagi kohort penemuan, kohort pengesahan dalaman dan kohort pengesahan luaran telah dijalankan di Pusat Metabolomik Universiti Sun Yat-sen. Makmal luaran Pusat Analisis dan Pengujian Universiti Teknologi Guangdong juga menganalisis 40 sampel daripada kohort luaran untuk menguji prestasi model pengelas.
Selepas pengekstrakan dan pembentukan semula, kuantiti mutlak metabolit serum diukur menggunakan kromatografi cecair prestasi ultra tinggi-spektrometri jisim tandem (Agilent 6495 triple quadrupole) dengan sumber pengionan elektrosemburan (ESI) dalam mod pemantauan tindak balas berganda (MRM). Lajur Amida ACQUITY BEH (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) digunakan untuk mengasingkan metabolit. Fasa bergerak terdiri daripada 90% (A) dan 5% asetonitril (B) dengan 10 mmol/L ammonium asetat dan larutan ammonia 0.1%. Program kecerunan adalah seperti berikut: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0%B. Lajur dikekalkan pada suhu 40 °C dan sampel pada suhu 10 °C dalam autosampler. Kadar aliran ialah 0.3 mL/min dan isipadu suntikan ialah 1 μL. Parameter MS ditetapkan seperti berikut: voltan kapilari ±3.5 kV, tekanan nebulizer 35 psi, aliran gas sarung 12 L/min, suhu gas sarung 350°C, suhu gas pengeringan 250°C, dan aliran gas pengeringan 14 l/min. Penukaran MRM triptofan, piruvat, laktat, hipoksantina dan xantina masing-masing ialah 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 dan 151.0–107.9. Data dikumpul menggunakan Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Bagi sampel serum, triptofan, piruvat, laktat, hipoksantina dan xantina telah diukur menggunakan lengkung penentukuran larutan campuran piawai. Bagi sampel sel, kandungan triptofan telah dinormalisasikan kepada piawai dalaman dan jisim protein sel.
Pengekstrakan puncak (m/z dan masa pengekalan (RT)) telah dilakukan menggunakan Compound Discovery 3.1 dan TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Untuk menghapuskan perbezaan potensi antara kelompok, setiap puncak ciri sampel ujian dibahagikan dengan puncak ciri bahan rujukan daripada kelompok yang sama untuk mendapatkan kelimpahan relatif. Sisihan piawai relatif piawaian dalaman sebelum dan selepas penyeragaman ditunjukkan dalam Jadual Tambahan 6. Perbezaan antara kedua-dua kumpulan dicirikan oleh kadar penemuan palsu (FDR<0.05, ujian pangkat bertanda Wilcoxon) dan perubahan lipatan (>1.2 atau <0.83). Data MS mentah bagi ciri yang diekstrak dan data MS yang dibetulkan serum rujukan ditunjukkan dalam Data Tambahan 1 dan Data Tambahan 2. Anotasi puncak dilakukan berdasarkan empat tahap pengenalpastian yang ditakrifkan, termasuk metabolit yang dikenal pasti, sebatian yang dianotasi secara putatif, kelas sebatian yang diciri secara putatif, dan sebatian yang tidak diketahui 22. Berdasarkan carian pangkalan data dalam Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), sebatian biologi dengan piawaian yang disahkan padanan MS/MS atau anotasi padanan tepat dalam mzCloud (skor > 85) atau Chemspider akhirnya dipilih sebagai perantaraan antara metabolit pembezaan. Anotasi puncak untuk setiap ciri disertakan dalam Data Tambahan 3. MetaboAnalyst 5.0 telah digunakan untuk analisis univariat bagi kelimpahan metabolit ternormalisasi jumlah. MetaboAnalyst 5.0 juga menilai analisis pengayaan laluan KEGG berdasarkan metabolit yang berbeza secara signifikan. Analisis komponen utama (PCA) dan analisis diskriminan kuasa dua terkecil separa (PLS-DA) telah dianalisis menggunakan pakej perisian ropls (v.1.26.4) dengan normalisasi tindanan dan penskalaan automatik. Model biomarker metabolit optimum untuk meramalkan keganasan nodul telah dijana menggunakan regresi logistik binari dengan pengecutan dan operator pemilihan paling rendah mutlak (LASSO, pakej R v.4.1-3). Prestasi model diskriminan dalam set pengesanan dan pengesahan dicirikan dengan menganggarkan AUC berdasarkan analisis ROC mengikut pakej pROC (v.1.18.0.). Kebarangkalian optimum diperoleh berdasarkan indeks Youden maksimum model (sensitiviti + spesifisiti – 1). Sampel dengan nilai kurang atau lebih besar daripada ambang akan diramalkan sebagai nodul jinak dan adenokarsinoma paru-paru, masing-masing.
Sel A549 (#CCL-185, Koleksi Budaya Jenis Amerika) telah ditumbuhkan dalam medium F-12K yang mengandungi 10% FBS. Urutan RNA jepit rambut pendek (shRNA) yang menyasarkan SLC7A5 dan kawalan bukan penyasaran (NC) telah dimasukkan ke dalam vektor lentiviral pLKO.1-puro. Urutan antisense shSLC7A5 adalah seperti berikut: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antibodi kepada SLC7A5 (#5347) dan tubulin (#2148) telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel. Antibodi kepada SLC7A5 dan tubulin telah digunakan pada pencairan 1:1000 untuk analisis Western blot.
Ujian Tekanan Glikolitik Seahorse XF mengukur tahap pengasidan ekstraselular (ECAR). Dalam ujian ini, glukosa, oligomisin A dan 2-DG diberikan secara berurutan untuk menguji kapasiti glikolitik selular seperti yang diukur oleh ECAR.
Sel A549 yang ditransfeksi dengan kawalan bukan sasaran (NC) dan shSLC7A5 (Sh1, Sh2) telah disadur semalaman dalam piring berdiameter 10 cm. Metabolit sel telah diekstrak dengan 1 ml metanol akueus 80% yang sejuk. Sel dalam larutan metanol telah dikikis, dikumpulkan ke dalam tiub baharu, dan disentrifugasi pada 15,000 × g selama 15 minit pada suhu 4°C. Kumpul 800 µl supernatan dan keringkan menggunakan penumpu vakum berkelajuan tinggi. Pelet metabolit kering kemudiannya dianalisis untuk tahap triptofan menggunakan LC-MS/MS seperti yang diterangkan di atas. Tahap NAD(H) selular dalam sel A549 (NC dan shSLC7A5) telah diukur menggunakan kit kolorimetrik NAD+/NADH kuantitatif (#K337, BioVision) mengikut arahan pengilang. Tahap protein telah diukur untuk setiap sampel untuk menormalkan jumlah metabolit.
Tiada kaedah statistik digunakan untuk menentukan saiz sampel secara awal. Kajian metabolomik sebelum ini yang bertujuan untuk penemuan biomarker15,18 telah dianggap sebagai penanda aras untuk penentuan saiz, dan berbanding dengan laporan ini, sampel kami adalah mencukupi. Tiada sampel dikecualikan daripada kohort kajian. Sampel serum telah ditugaskan secara rawak kepada kumpulan penemuan (306 kes, 74.6%) dan kumpulan pengesahan dalaman (104 kes, 25.4%) untuk kajian metabolomik yang tidak disasarkan. Kami juga memilih secara rawak 70 kes daripada setiap kumpulan daripada set penemuan untuk kajian metabolomik yang disasarkan. Penyiasat tidak diberi pendedahan kepada tugasan kumpulan semasa pengumpulan dan analisis data LC-MS. Analisis statistik data metabolomik dan eksperimen sel diterangkan dalam bahagian Keputusan, Legenda Rajah dan Kaedah masing-masing. Kuantifikasi triptofan selular, NADT dan aktiviti glikolitik telah dilakukan tiga kali secara bebas dengan keputusan yang sama.
Untuk maklumat lanjut tentang reka bentuk kajian, sila lihat Abstrak Laporan Portfolio Semula Jadi yang berkaitan dengan artikel ini.
Data MS mentah bagi ciri-ciri yang diekstrak dan data MS ternormalisasi bagi serum rujukan masing-masing ditunjukkan dalam Data Tambahan 1 dan Data Tambahan 2. Anotasi puncak untuk ciri pembezaan dibentangkan dalam Data Tambahan 3. Set data LUAD TCGA boleh dimuat turun daripada https://portal.gdc.cancer.gov/. Data input untuk memplot graf disediakan dalam data sumber. Data sumber disediakan untuk artikel ini.
Kumpulan Kajian Saringan Paru-paru Kebangsaan, dsb. Mengurangkan kematian kanser paru-paru dengan tomografi berkomputer dos rendah. Northern England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR dan Prophet, PC Saringan kanser paru-paru menggunakan CT heliks dos rendah: keputusan daripada Kajian Saringan Paru-paru Kebangsaan (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, dkk. Mengurangkan kematian akibat kanser paru-paru dengan saringan CT volumetrik dalam percubaan rawak. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Masa siaran: 18-Sep-2023